目的應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(GRK2)雜合敲除(GRK2~(+/-))小鼠,用于疾病病理機制及藥物靶點研究。方法構(gòu)建靶向敲除GRK2基因的載體,在體外將先導(dǎo)RNA和Cas9 mRNA顯微注射到C57BL/6小鼠的受精卵中,在小鼠GRK2基因的第3個外顯子上造成基因突變,通過PCR及基因測序測定F0代基因型,成功獲得13bp和19bp敲除兩種GRK2~(+/-)小鼠。因GRK2純合子敲除胚胎期死亡,將19bp敲除F0代小鼠與C57BL/6小鼠回交,獲得穩(wěn)定的19bp敲除F1代GRK2~(+/-)小鼠用于擴繁及實驗。結(jié)果 GRK2~(+/-)小鼠基因型穩(wěn)定,體重較同齡C57BL/6小鼠低,Western blot檢測證實GRK2~(+/-)小鼠心臟、脾臟、胸腺、肝臟、巨噬細胞及腎臟組織中GRK2蛋白的表達均顯著降低。結(jié)論該研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功建立了GRK2~(+/-)小鼠模型,為進一步研究GRK2在多種臟器、細胞發(fā)育中的作用,疾病發(fā)病機制及藥物作用靶點提供了重要的動物模型。
【部分圖文】：

將體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA與Cas9 mRNA混合后顯微注射到C57BL/6小鼠受精卵中,將受精卵移植進C57BL/6雌性小鼠體內(nèi),生產(chǎn)出10只F0代小鼠。表1 sgRNA PCR退火程序的反應(yīng)體系 反應(yīng)條件 體積(μl) S1 oligos 1.0 S2 oligos 1.0 10× T4 ligation buffer 1.0 T4 PNK 0.5 雙蒸水 6.5 總體積 10.0

將體外轉(zhuǎn)錄擴增的sgRNA與Cas9 mRNA的混合物顯微注射入C57BL/6小鼠受精卵中,獲得10只F0代小鼠,編號為1#-7#、8#-1、8#-2、9#,提取尾部DNA經(jīng)PCR擴增后進行測序(圖2A和2B),測序結(jié)果表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用于GRK2基因的19號染色體的第三個外顯子上,其中2#小鼠刪除了19 bp堿基,3#、4#小鼠刪除了20 bp堿基,8#-1小鼠缺失13 bp堿基,8#-2雖然缺少了1 bp堿基但卻插入了16 bp堿基導(dǎo)致插入了15 bp堿基,9#插入了21 bp堿基。由于8-2#,9#小鼠插入的堿基個數(shù)是3的倍數(shù),因此未能實現(xiàn)基因的確定突變,因此得到4只F0代GRK2+/-小鼠。2.2 獲得GRK2基因雜合敲除F1代小鼠

GRK2屬于絲/蘇氨酸激酶家族,磷酸化GPCRs,GRK2與β-arrestin共同調(diào)控GPCRs的脫敏及內(nèi)吞,為GRK2最經(jīng)典的作用[8],最近研究[2]表明GRK2也可直接磷酸化微管蛋白、核糖體蛋白、鈉通道及參與ERK、MAPK和NF-κB等信號通路的調(diào)控,并且通過誘導(dǎo)Smad磷酸化來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)介導(dǎo)的細胞生長停滯和凋亡,在細胞的生長發(fā)育中起到關(guān)鍵作用。因此,GRK2在多種慢性疾病包括心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫病以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要作用。圖4 F2代小鼠基因鑒定
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