【摘要】：瘧疾依然是世界上對人類生命健康最具威脅的傳染病之一。由于紅內期是引起瘧疾患者發(fā)病和死亡的關鍵時期,所以紅內期瘧原蟲的增殖和發(fā)育機制一直是研究的重點和熱點。已知紅內期原蟲在增殖過程中能被宿主免疫系統(tǒng)識別,機體內包括免疫細胞、細胞因子和抗體等在內的多種免疫效應分子在抗紅內期瘧原蟲感染均發(fā)揮了十分重要的作用。然而,紅內期瘧原蟲在與宿主長期共同進化的歷史中,也發(fā)育出了一系列精密而完善的免疫逃避和免疫抑制機制。一方面,它可通過隱藏、偽裝、變異和粘附等方式規(guī)避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊,另一方面,它也善于利用宿主體內多種維持機體免疫動態(tài)平衡的負向調控分子來抑制宿主的免疫應答。比如在表達于T細胞、B細胞及NKT細胞表面的PD-1及表達于活化T細胞表面的CTLA-4,均已有文獻報道在瘧疾紅內期感染中發(fā)揮重要作用,它們的活化將抑制或耗竭免疫效應細胞,促進瘧原蟲增殖和發(fā)育。纖維蛋白原樣蛋白2(fibrinogen-like protein 2,FGL2),又稱纖維介素(Fibroleukin),最初發(fā)現(xiàn)于感染鼠肝炎病毒(MHV-3)的小鼠體內,包含膜蛋白型mFGL2和分泌型sFGL2。mFGL2主要在內皮細胞、上皮細胞、巨噬細胞上表達,具有直接激活凝血酶啟動凝血的功能。sFGL2主要由活化的調節(jié)性T細胞(Regulatory T cell,Treg)分泌,通過與細胞表面受體FcγRIIB結合發(fā)揮免疫調節(jié)作用,包括抑制DC細胞成熟進而抑制T淋巴細胞增殖和細胞因子的分泌、以及促進B細胞凋亡。sFGL2的免疫抑制作用近年來不斷在腫瘤和一些炎性疾病模型中得到了證實。然而,關于sFGL2在瘧原蟲感染中的作用,目前尚未見任何報道。本課題研究首先檢測惡性瘧和間日瘧患者以及夏氏瘧原蟲感染小鼠血清中的sFGL2的表達水平,觀察其是否在瘧疾紅內期感染過程中表達上調。然后,我們利用FGL2缺失小鼠進行紅內期感染實驗,觀察FGL2缺失后紅內期原蟲的增殖水平有無變化,明確FGL2在紅內期感染中的作用。最后,對FGL2缺失影響紅內期原蟲增殖的分子機制展開深入探討。一、sFGL2在瘧疾紅內期感染中表達顯著上調1、sFGL2在瘧疾紅內期感染中表達顯著上調:通過檢測惡性瘧和間日瘧患者以及夏氏瘧原蟲感染小鼠血清中的sFGL2的表達水平,結果發(fā)現(xiàn)sFGL2在惡性瘧和間日瘧患者血清中表達水平較流行區(qū)正常人顯著提高,夏氏瘧原蟲感染小鼠血清中的sFGL2的表達水平也隨著紅內期原蟲的增殖而不斷提高,并與原蟲曲線高度吻合。2、Treg細胞是紅內期感染中表達上調的sFGL2的主要來源:首先采用FACS檢測感染小鼠在感染后第2、4、6、8天脾臟CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg細胞的頻率,發(fā)現(xiàn)Treg細胞頻率隨紅內期原蟲的增殖而不斷升高。隨后我們采用磁珠分選出CD4~+CD25~+Treg細胞,以CD4~+CD25~-T細胞和CD4~-CD25~-T細胞作為對照,定量檢測FGL2 mRNA在各群細胞中的表達水平,發(fā)現(xiàn)CD4~+CD25~+Treg細胞高表達FGL2 mRNA。最后,我們還采用anti-CD25抗體耗竭CD4~+CD25~+Treg細胞,結果顯示注射anti-CD25抗體小鼠血清中sFGL2的表達水平較未注射抗體的WT小鼠顯著下降。以上實驗充分證明CD4~+CD25~+Treg細胞是紅內期感染中表達升高的sFGL2的主要來源。二、FGL2缺失后紅內期原蟲增殖受到顯著抑制1、FGL2~(-/-)感染小鼠體內原蟲增殖受到顯著抑制:為進一步明確FGL2在紅內期感染過程中的作用,隨后我們引進了FGL2敲除小鼠進行感染實驗。結果發(fā)現(xiàn),無論是夏氏瘧原蟲、伯氏瘧原蟲還是約氏瘧原蟲感染,FGL2缺失后都將顯著抑制它們在小鼠體內的增殖,而對FGL2敲除小鼠回補重組FGL2蛋白則使現(xiàn)象逆轉,證明FGL2在瘧疾紅內期感染中發(fā)揮重要作用,參與了紅內期原蟲的免疫逃避并促進其增殖。2、FGL2~(-/-)小鼠的凝血功能沒有受到顯著影響:FGL2敲除后將同時導致sFGL2和mFGL2的缺失,而mFGL2的缺失可能導致凝血功能的異常,為此,我們檢測了WT和FGL2~(-/-)小鼠斷尾出血時間和凝血時間,結果顯示FGL2~(-/-)小鼠凝血功能并沒有受到顯著影響。三、FGL2缺失并未增強抗紅內期感染的適應性免疫1、缺失FGL2不影響瘧原蟲特異性CD8~+T細胞的增殖和功能:紅內期原蟲感染后第4、5、6天,通過流式分析瘧原蟲特異性CD8~+T細胞增殖和功能,結果發(fā)現(xiàn),FGL2敲除小鼠脾臟瘧原蟲特異性CD8~+T細胞的增殖能力與WT感染小鼠無顯著差異。顆粒酶、穿孔素和IFN-γ分泌能力與WT感染小鼠相比也沒有顯著差異。2、缺失FGL2不影響瘧原蟲特異性CD4~+T細胞的增殖和功能:紅內期原蟲感染后第4、5、6天,通過流式分析瘧原蟲特異性CD4~+T細胞活化。結果顯示,紅內期原蟲感染后第7、14、21天,FGL2敲除小鼠脾臟瘧原蟲特異性CD4~+T細胞的活化增殖以及IFN-γ分泌能力與WT感染小鼠相比沒有顯著差異。3、缺失FGL2不影響GC B細胞頻率:鑒于GC B細胞在瘧原蟲特異性抗體分泌中的重要作用,我們檢測了WT和FGL2~(-/-)兩組感染小鼠脾臟GC B細胞(B220~+CD95~+GL7~+)的頻率和數(shù)量,結果發(fā)現(xiàn)兩組感染小鼠之間沒有顯著差異。4、缺失FGL2不影響瘧原蟲特異性抗體分泌:由于抗體在清除瘧疾紅內期瘧原蟲中發(fā)揮了關鍵作用,我們檢測了WT和FGL2~(-/-)兩組感染小鼠血清中瘧原蟲特異性抗體IgG及其亞類IgG1和IgG2a的滴度,結果也顯示兩組感染小鼠之間沒有顯著差異。四、FGL2缺失顯著增強抗紅內期感染的天然免疫1、FGL2缺失小鼠的IFN-γ表達水平顯著升高,是抑制紅內期原蟲增殖的主要原因:鑒于FGL2敲除小鼠體內瘧原蟲的增殖受到顯著抑制出現(xiàn)在感染后第4天,因此我們檢測了兩種小鼠在感染后2、4、6天血清中IFN-γ的表達情況。結果顯示,感染后第6天,IFN-γ在FGL2缺失小鼠體內表達水平較WT小鼠顯著提高。為了進一步證實IFN-γ在FGL2敲除小鼠抑制紅內期原蟲增殖中的作用,我們采用拮抗抗體中和IFN-γ,結果顯示,與FGL2~(-/-)組和isotype IgG組相比,中和IFN-γ后,FGL2敲除小鼠體內瘧原蟲增殖能力恢復到WT感染小鼠水平,說明FGL2敲除小鼠是通過調節(jié)分泌IFN-γ發(fā)揮抗瘧原蟲作用的。2、NK和NKT細胞是FGL2~(-/-)實驗小鼠血清中表達上調的IFN-γ的主要來源:我們檢測了兩種小鼠在感染后2、4、6天脾臟NK和NKT細胞分泌IFN-γ的頻率及數(shù)目。結果顯示,感染后第6天,FGL2~(-/-)小鼠脾臟分泌IFN-γ的NK和NKT細胞數(shù)目顯著高于WT小鼠。為了進一步證實增強的NK/NKT分泌IFN-γ有助于FGL2~(-/-)小鼠抑制紅內期原蟲增殖,WT和FGL2~(-/-)小鼠在感染過程中用抗NK1.1抗體特異耗竭NK細胞和NKT細胞。結果發(fā)現(xiàn),FGL2~(-/-)小鼠NK/NKT細胞耗竭后,原蟲血癥較注射對照抗體組和FGL2~(-/-)組明顯增加。因此,在FGL2~(-/-)感染小鼠中顯著減少的原蟲蟲荷是由于NK和NKT細胞分泌IFN-γ增強所致。3、缺失FGL2使感染小鼠MCP-1表達水平升高,后者是募集NK/NKT細胞增多的主要原因:我們比較了WT和FGL2~(-/-)小鼠感染后2、4、6天血清中MCP-1的表達水平,發(fā)現(xiàn)FGL2~(-/-)小鼠血清中MCP-1表達水平在感染后第6天較WT小鼠顯著提高。為進一步驗證MCP-1的重要作用,我們采用了MCP-1的拮抗抗體。結果顯示,缺失MCP-1可完全阻斷FGL2~(-/-)小鼠脾臟NK細胞和NKT細胞的募集。同樣地,MCP-1耗竭后,FGL2~(-/-)小鼠的原蟲血癥也恢復到WT小鼠的水平。以上結果表明MCP-1介導的NK/NKT細胞募集在抑制FGL2~(-/-)小鼠紅內期原蟲增殖中發(fā)揮重要作用。4、巨噬細胞是FGL2~(-/-)小鼠血清中表達上調的MCP-1的主要來源:接下來,我們探查了FGL2~(-/-)實驗小鼠血清中表達上調的MCP-1的細胞來源。已有文獻證實MCP-1主要由巨噬細胞產(chǎn)生,因此我們比較了WT和FGL2~(-/-)感染小鼠巨噬細胞產(chǎn)生MCP-1的能力。結果發(fā)現(xiàn),FGL2~(-/-)小鼠巨噬細胞產(chǎn)生MCP-1的能力明顯高于WT小鼠。進一步研究發(fā)現(xiàn),FGL2~(-/-)小鼠脾臟中分泌MCP-1的巨噬細胞的總數(shù)也遠遠高于WT小鼠。這有力地表明了生成的MCP-1對募集更多的巨噬細胞到脾臟起正反饋作用,從而促進更多的MCP-1的產(chǎn)生。五、FGL2缺失增強抗紅內期感染的天然免疫的分子機制1、sFGL2能夠直接抑制巨噬細胞產(chǎn)生MCP-1的能力:從FGL2缺失小鼠的實驗結果可知,FGL2的存在抑制了巨噬細胞分泌MCP-1的能力,但卻沒有直接的實驗證據(jù)表明sFGL2能夠直接抑制巨噬細胞產(chǎn)生MCP-1。為此,我們將重組FGL2蛋白(rFGL2)加入到瘧原蟲裂解產(chǎn)物pRBC刺激的RAW264.7細胞株和小鼠骨髓來源巨噬細胞(BMDM)中,通過ELISA檢測MCP-1的表達,結果發(fā)現(xiàn),無論是RAW264.7細胞株還是BMDM,在加入rFGL2后,均能顯著抑制pRBC誘導巨噬細胞分泌MCP-1的能力,證明sFGL2能夠直接作用于巨噬細胞抑制其產(chǎn)生MCP-1。2、sFGL2通過FcγRIIB受體抑制巨噬細胞產(chǎn)生MCP-1的能力:已知表達于多種免疫細胞表面的FcγRIIB是sFGL2的作用受體,而巨噬細胞表面也存在FcγRIIB受體,因此我們在RAW264.7細胞株中,將FcγRIIB的拮抗抗體加入到pRBC與rFGL2共孵育的刺激孔中,結果顯示sFGL2的抑制作用被廢除,抗FcγRIIB抗體、pRBC與rFGL2共孵育的刺激孔的MCP-1的表達水平恢復到pRBC單獨刺激孔的水平,這個結果也在BMDM中得到了印證。由此證明紅內期感染中表達上調的sFGL2是通過FcγRIIB受體發(fā)揮抑制作用。3、sFGL2的抑制作用在巨噬細胞條件缺失FcγRIIB受體小鼠的BMDM中消失,巨噬細胞條件缺失FcγRIIB受體小鼠紅內期原蟲增殖受到顯著抑制:隨后,我們通過構建巨噬細胞條件缺失FcγRIIB受體小鼠,再次驗證sFGL2-FcγRIIB信號的抑制作用。通過分離巨噬細胞條件缺失FcγRIIB受體小鼠的BMDM,將pRBC與rFGL2共孵育,經(jīng)ELISA檢測發(fā)現(xiàn),pRBC單獨刺激孔與pRBC和rFGL2共孵育孔,兩者MCP-1的表達水平不再有差異,確實了sFGL2通過結合FcγRIIB抑制巨噬細胞產(chǎn)生MCP-1。另外,我們還用巨噬細胞條件缺失FcγRIIB受體小鼠進行了夏氏瘧原蟲紅內期感染實驗,結果顯示,巨噬細胞條件缺失FcγRIIB受體小鼠的原蟲率在感染過程中顯著低于WT對照小鼠,再次有力證明sFGL2通過FcγRIIB發(fā)揮抑制作用。4、sFGL2-FcγRIIB信號抑制巨噬細胞產(chǎn)生MCP-1的分子機制:首先我們對巨噬細胞產(chǎn)生MCP-1的分子機制作了調查,已知胞內的NF-κB和MAPK信號通路與MCP-1的產(chǎn)生有關,而MAPK信號下游又包含ERK、p38和JNK三條支路。我們通過將多種信號通路抑制劑加入到pRBC刺激的RAW264.7細胞中,結果發(fā)現(xiàn),除了p38沒有作用外,其他信號抑制劑的加入,均能一定程度阻斷MCP-1的產(chǎn)生,說明NF-κB和MAPK信號通路均參與瘧原蟲誘導巨噬細胞產(chǎn)生MCP-1。接下來,我們選取了兩條信號通路上游共有的信號分子TAK1以及下游不同的信號分子IκBα、MKK4/7和JNK,通過western blot檢測這些信號分子在pRBC刺激以及pRBC與rFGL2共孵育情況下的活化情況,來判斷sFGL2-FcγRIIB信號作用的位點及通路,然后將結果在巨噬細胞條件缺失FcγRIIB受體小鼠的BMDM中進行驗證。我們首先觀察了MKK4/7-JNK支路的活化情況,結果發(fā)現(xiàn),sFGL2-FcγRIIB信號對MKK4/7的活化沒有顯著影響,但可以顯著抑制JNK的活化,提示sFGL2-FcγRIIB信號可能作用于MAPK通路下游JNK支路。但是,由于時間關系,在本論文寫作時,sFGL2-FcγRIIB信號是否對另一條NF-κB通路有影響,鑒定工作正在進行中而尚未完成。
【學位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R382.31
【圖文】：

圖 2-1 sFGL2 在瘧疾紅內期感染中的表達水平。A，sFGL2 在人瘧中的表達水平。NC：沈陽地區(qū)正常人；EC：流行區(qū)正常人；Pf：惡性瘧患者；Pv：間日瘧患者。B，sFGL2 在夏氏瘧原蟲感染小鼠中的表達水平。***表示 p < 0.001，**表示 p < 0.01，*表示 p < 0.05。Fig.2-1 The expression level of sFGL2 in malaria bloog stage infection. A, The expression level ofsFGL2 in human malaria. NC: normal control in Shenyang area; EC: edematic area control; Pf:Plasmodium falciparum; Pv: Plasmodium vivax. B, The expression level of sFGL2 in mice infected withPlasmodium chabaudi. *** p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05.2.2.2 Treg 細胞是紅內期感染中表達上調的 sFGL2 的主要來源FGL2 在機體內主要有兩種存在形式，膜型 mFGL2 和分泌型 sFGL2。mFGL2 主要由內皮細胞、上皮細胞、巨噬細胞表達，而 sFGL2 已知可由 CD4+T 細胞和 CD8+T 細胞分泌，且活化的 CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞是其主要來源。本研究首先采用 FACS檢測感染小鼠在感染后第 2、4、6、8 天脾臟 CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞的頻率，結果發(fā)現(xiàn) Treg 細胞頻率隨紅內期原蟲的增殖而不斷升高（圖 2-2A，B，C），與 sFGL2 的表

圖 2-2 Treg 在紅內期感染中的表達情況。A, 小鼠脾臟 Treg 細胞頻率流式圖。 B, 小鼠Treg 細胞頻率柱狀圖。C，小鼠脾臟 Treg 細胞數(shù)目柱狀圖。D，感染后第 8 天，F(xiàn)GL2 mRNA達水平。E，sFGL2 在夏氏瘧原蟲感染小鼠中的表達水平。***表示 p < 0.001，**表示 p < 0.01，示 p < 0.05。Fig.2-2 The expression of Treg in malaria blood stage infection. A, Gating strategy oCD4+CD25+Foxp3+Treg cells. B, Frequency histogram of splenic CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in ma histogram of the number of splenic CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in mice. D, the expression leFGL2 mRNA on 8 days post infection. E, The expression level of sFGL2 in mice infectedPlasmodium chabaudi. *** p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05.23

t 檢驗或單因素方差分析，認定 p < 0.05 為結果具有統(tǒng)計學差異。3.2 結 果3.2.1 FGL2-/-感染小鼠體內原蟲增殖受到顯著抑制為進一步明確 FGL2 在紅內期感染過程中的作用，隨后我們從本校免疫學研究所引進了 FGL2 敲除小鼠進行感染實驗。結果發(fā)現(xiàn)，從感染后第 2 天開始直到第 8 天 WT 小鼠原蟲率達到頂峰，F(xiàn)GL2缺失小鼠體內原蟲水平始終顯著低于WT感染小鼠（圖3-1 A），表明紅內期原蟲的增殖在 FGL2 缺失后受到顯著抑制。另外，P.c 瘧原蟲感染的 WT 小鼠在 D16 和 D20 還會出現(xiàn)一個原蟲率的小峰，而 FGL2 缺失小鼠能在短期內完全清除紅內期原蟲（圖 3-1 B）。此外，我們還用伯氏瘧原蟲 ANKA-Luciferase 株和約氏瘧原蟲 BY265 株進行了重復驗證。結果同樣顯示，感染期間 FGL2 缺失小鼠體內蟲荷顯著低于 WT 小鼠（圖 3-1 C, D）。以上結果有力證明了 FGL2 在瘧疾紅內期感染中發(fā)揮重要作用，參與了紅內期原蟲的免疫逃避并促進其增殖。
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中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 付雍;FGL2在紅內期瘧原蟲發(fā)育中的作用和機制研究[D];中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學;2018年

本文編號：2851544