目的調(diào)查揚州6個地區(qū)白紋伊蚊感染W(wǎng)olbachia的規(guī)律,分析揚州6個地區(qū)的白紋伊蚊線粒體DNA COI基因遺傳多樣性,初步探究內(nèi)共生菌Wolbachia對白紋伊蚊線粒體DNACOI基因多樣性的影響,為將來基于Wolbachia特性對蚊媒及蚊媒病的控制奠定基礎(chǔ)。方法1.2017年7月-10月,采集揚州6個地區(qū)的白紋伊蚊,提取單只蚊蟲的DNA,利用Wolbachia wsp基因的通用型和分型引物分別進行PCR擴增,統(tǒng)計陽性樣本的數(shù)量,分析其感染規(guī)律。2.利用線粒體DNA COI基因特異性引物對蚊蟲DNA樣本進行PCR反應(yīng),PCR產(chǎn)物經(jīng)測序儀測序后,通過DnaSP5.1軟件分析COI基因的遺傳多樣性。3.利用生物信息學(xué)分析方法,對感染W(wǎng)olbachia和不感染W(wǎng)olbachia的白紋伊蚊種群的線粒體DNA多樣性進行分析比較。結(jié)果利用Wolbachia wsp基因的通用型引物進行PCR擴增的結(jié)果顯示,揚州市6個不同地區(qū)的白紋伊蚊種群的感染頻率在27.5%～67.5%之間;利用A大組和B大組的特異性引物的檢測結(jié)果為:只感染A組的頻率為0～22.5%,只感染B組的頻率為5%～17.5%,共同感染A和B的頻率為0～35%。對白紋伊蚊COI基因進行PCR擴增,測序所獲得的序列用MEGA6.0分析的結(jié)果為:A+T含量為67.93%,C+G含量為32.07%,核苷酸多樣性(Pi)為0.28190,單倍型多樣性(Hd)為0.933。基于COI基因序列構(gòu)建的進化樹表明,邗江區(qū)、江都區(qū)采樣點的白紋伊蚊聚成一小分支后又與廣陵區(qū)和儀征區(qū)聚成一類,高郵市與寶應(yīng)縣采集點的白紋伊蚊單獨聚為一支,該結(jié)果說明揚州不同的白紋伊蚊種群之間存在一定水平的基因交流。除了廣陵區(qū)種群以外,其他5個種群中不感染W(wǎng)olbachia的白紋伊蚊線粒體COI基因的單倍型多樣性數(shù)(Hd)、核苷酸多樣性數(shù)(Pi)和核苷酸平均差異數(shù)(K)均比感染W(wǎng)olbachia的要高。結(jié)論1.揚州市白紋伊蚊種群體內(nèi)感染W(wǎng)olbachia表現(xiàn)出多樣性,有Wolbachia雙重感染現(xiàn)象。2.揚州6個白紋伊蚊種群的線粒體DNA COI基因有一定水平的交流。3.感染W(wǎng)olbachia的白紋伊蚊種群的線粒體DNA COI基因核苷酸多樣性和單倍型多樣性均低于不感染W(wǎng)olbachia的白紋伊蚊種群,Wolbachia對寄主的線粒體DNA的多樣性具有一定的影響。
【學(xué)位單位】：安徽理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R384.1
【部分圖文】：

（６）?ｌＯｘＰＣＲ?Ｂｕｆｆｅｒ?（無?Ｍｇ２＋）?ＴａＫａＲａ?公司??（７）?ＭｇＣｂ?（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）?ＴａＫａＲａ?公司??（８）?ｄＮＴＰ?Ｍｉｘｔｕｒｅ?（２．５?ｍｍｏｌ／Ｌ）?ＴａＫａＲａ?公司??（９）?ＴａｑＤＮＡ?聚合酶（５Ｕ／ｆｘＬ）?ＴａＫａＲａ?公司??（１０）?ＤＥＰＣ?國產(chǎn)分析純??（１１）無水乙醇?美國Ｓｉｇｍａ公司??．３實驗方法??．３．１白紋伊蚊的采集方法??采集江蘇省揚州市６個地區(qū)的白紋伊蚊，并用ＧＰＳ定位儀記錄下每個采樣點??坐標，采集時間均為２０１７年７月－１０月，采集地點的分布見圖１。采用人誘法：??晚時分，采樣者著深色衣褲或者直接裸露小腿站在蚊蟲孳生地的周圍，用電動??蚊器吸捕刺叮在小腿上的蚊蟲。將采集的白紋伊蚊保存于無水乙醇中，帶回實??室后保存于－２０°Ｃ或立即進行ＤＮＡ的提取。樣品來源及各采集點的信息如表１。??

１．４．２．２?ＣＯＩ基因的ＰＣＲ擴增結(jié)果??ＰＣＲ產(chǎn)物用毛細管電泳儀檢測，以ｌＯＯＯｂｐ的Ｍａｒｋｅｒ作為標記，電泳后可見??所有電泳結(jié)果目的條帶均在６８０ｂｐ左右。圖６為白紋伊蚊ＣＯＩ基因的擴增結(jié)果電??泳圖。??１．４．２．?３白紋伊蚊的分子鑒定結(jié)果??把測序結(jié)果拼接后，與ＮＣＢＩ網(wǎng)站上的ＧｅｎＢａｎｋ中的白紋伊蚊ＣＯＩ基因序列??進行ＢＬＡＳＴ，同源性均大于９７％。所測結(jié)果表明，所采集的６個地點的蚊蟲全部??都是白紋伊蚊，無其他蚊種，可用來進行后續(xù)的實驗研宄。??－１２－??

１．４．２．２?ＣＯＩ基因的ＰＣＲ擴增結(jié)果??ＰＣＲ產(chǎn)物用毛細管電泳儀檢測，以ｌＯＯＯｂｐ的Ｍａｒｋｅｒ作為標記，電泳后可見??所有電泳結(jié)果目的條帶均在６８０ｂｐ左右。圖６為白紋伊蚊ＣＯＩ基因的擴增結(jié)果電??泳圖。??１．４．２．?３白紋伊蚊的分子鑒定結(jié)果??把測序結(jié)果拼接后，與ＮＣＢＩ網(wǎng)站上的ＧｅｎＢａｎｋ中的白紋伊蚊ＣＯＩ基因序列??進行ＢＬＡＳＴ，同源性均大于９７％。所測結(jié)果表明，所采集的６個地點的蚊蟲全部??都是白紋伊蚊，無其他蚊種，可用來進行后續(xù)的實驗研宄。??－１２－??
【參考文獻】

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本文編號：2851883