目的綠色熒光蛋白(GFP)基因轉(zhuǎn)染標記版納微型豬骨髓間充質(zhì)干細胞(pBMSC),分析GFP轉(zhuǎn)染對pBMSC增殖和成脂分化的影響。方法以不同劑量攜帶GFP基因慢病毒共培養(yǎng)的方法轉(zhuǎn)染標記pBMSC,以hUCMSC為對照,流式分析方法檢測不同細胞GFP的陽性率,CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染細胞的增殖活性。觀察GFP標記的pBMSC成脂分化誘導后的脂滴形成,異丙醇溶解脂滴,測定各組光密度值并進行比較分析。結(jié)果以MOI為50和100的病毒載體劑量共培養(yǎng)72 h,可以成功標記p BMSC,MOI為50時pBMSC的GFP陽性率明顯低于hUCMSC的GFP陽性率(P 0.01)。轉(zhuǎn)染GFP的pBMSC生長曲線依然呈現(xiàn)"S"的分布特征,總體趨勢與hUCMSC相似。不同GFP陽性率的pBMSC和hUCMSC成脂分化后脂滴溶解液OD值沒有顯著差異(P 0.05)。結(jié)論 GFP轉(zhuǎn)染可以標記近交系版納微型豬來源的pBMSC,但不會顯著影響其增殖和成脂分化。
【部分圖文】：

轉(zhuǎn)染細胞CCK-8實驗結(jié)果顯示：GFP轉(zhuǎn)染的p BMSC生長曲線依然呈現(xiàn)“S”的分布特征，按照MOI為50的劑量轉(zhuǎn)染的p BMSC在傳代接種后第3到5 d時增殖能力略低于對照組p BMSC，而按照MOI為100的劑量轉(zhuǎn)染的p BMSC在傳代接種后第2 d后增殖能力就低于對照組p BMSC，但總體趨勢與對照組相似。見圖2。2.3 成脂分化及其比較分析

基于病毒性載體系統(tǒng)構(gòu)建的GFP基因轉(zhuǎn)染標記是一種轉(zhuǎn)染效率高、表達時間長的體內(nèi)示蹤技術方法，廣泛應用于再生醫(yī)學研究[6]。在人類免疫缺陷病毒HIV-1基礎上改造構(gòu)建的、攜帶GFP基因的慢病毒載體系統(tǒng)，能夠?qū)FP基因整合到宿主分裂細胞或非分裂細胞染色體上，借助細胞擴增而表達GFP蛋白，實現(xiàn)干細胞示蹤的目的。雖然慢病毒載體構(gòu)建時已經(jīng)處理了有毒的特定基因序列，但是GFP基因整合導致的基因插入突變風險依然存在。在前期研究獲得了p BMSC，并從0、25、50、100、200、400這些劑量中比較確定了MOI為50是LentivirusGFP慢病毒用于p BMSC的理想劑量。發(fā)現(xiàn)不同屬來源的干細胞GFP轉(zhuǎn)染研究報道中MOI值及其GFP的標記率明顯不同，使用MOI為50的慢病毒劑量，在兔骨髓間充質(zhì)干細胞獲得45.24%的GFP陽性率[3]，對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，僅用MOI為25的慢病毒劑量就獲得獲得97%的GFP陽性率[4]。p BMSC來源于近交系版納微型豬，是醫(yī)學研究十分難得的種子細胞。眾所周知，近交衰退是動物近親繁殖不可避免的結(jié)果,近交系版納微型豬在培育過程中發(fā)現(xiàn)了許多畸形個體。因此，本研究比較關注來源于近交系的p BMSC轉(zhuǎn)染GFP后的變化。結(jié)果顯示：按照MOI為50的劑量加入慢病毒與p BMSC共培養(yǎng)6 d，可以成功標記GFP，但相同條件下p BMSC的GFP陽性率顯著低于h UCMSC，表明Lentivirus-GFP慢病毒轉(zhuǎn)染效率與宿主細胞的生物學特性有關。既然病毒只能依賴宿主細胞基因編碼系統(tǒng)實現(xiàn)自我復制擴增，那么分裂增殖快的細胞理論上更容易獲得更高的GFP陽性表達率。本研究顯示：p BMSC和h UCMSC，無論哪個劑量的病毒轉(zhuǎn)染，不是所有細胞都可觀察到綠色熒光蛋白的表達。這可能與兩種不同種屬來源的細胞生物學特性及其不同增殖活性有關。豬骨髓間充質(zhì)干細胞生長相對緩慢[7]，而且不同品種豬來源的骨髓間充質(zhì)干細胞的分裂增殖潛能存在差異[8]，本研究相同MOI條件下p BMSC的GFP轉(zhuǎn)染率低于h UCMSC可能反映了近交系版納微型豬來源細胞對攜帶GFP基因的慢病毒易感性較低。本研究顯示：GFP轉(zhuǎn)染的p BMSC生長曲線依然呈現(xiàn)“S”的分布特征，按照MOI為100的劑量轉(zhuǎn)染的p BMSC生長曲線雖然總體變化趨勢與未轉(zhuǎn)染的對照組相似，但確有不同，而按照MOI為50的劑量轉(zhuǎn)染的p BMSC生長曲線幾乎與未轉(zhuǎn)染的對照組重疊，只是在傳代接種后第3到5 d區(qū)間不同，表明慢病毒轉(zhuǎn)染GFP的表達，一定程度上還是影響p BMSC的增殖活性，這與慢病毒介導GFP轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞的研究結(jié)果類似[3]，而脂質(zhì)體介導GFP轉(zhuǎn)染豬骨髓間充質(zhì)干細胞的研究則顯示GFP轉(zhuǎn)染可以改變細胞周期的比例，顯著抑制細胞增殖[5]。同樣是慢病毒介導GFP轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞，同樣是共培養(yǎng)24 h,MOI為50[3]和MOI為150[9]都能成功，提示篩選確定慢病毒最佳使用劑量對于特定宿主細胞而言很有必要，畢竟對細胞而言慢病毒就是異物，加入太多，至少影響了局部環(huán)境，可能干擾了細胞的生長和代謝。現(xiàn)有研究只是顯示高劑量慢病毒轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細胞有一定毒性，最佳劑量慢病毒轉(zhuǎn)染GFP的間充質(zhì)干細胞仍然可以誘導分化形成脂滴[5]。本研究首次誘導分化定量分析實驗顯示：本研究4個組細胞脂滴吸光度值之間比較均沒有顯著差異，表明不同劑量慢病毒轉(zhuǎn)染對p BMSC成脂分化效率沒有顯著影響，不同細胞GFP表達率的高低也不顯著影響干細胞成脂分化。結(jié)合不是所有細胞都可觀察到GFP表達的現(xiàn)象，暗示GFP轉(zhuǎn)染效率還有提升的空間。比如，濃縮慢病毒就可以提高GFP的轉(zhuǎn)染效率[10]。GFP轉(zhuǎn)基因標記種子細胞用于體內(nèi)示蹤[11]和組織器官重建[12]是再生醫(yī)學研究的重要發(fā)展方向，GFP轉(zhuǎn)基因標記技術值得進一步深入研究。圖2 成脂分化形態(tài)觀察及比較

圖1 不同劑量慢病毒共培養(yǎng)后細胞的形態(tài)和陽性率比較分離培養(yǎng)p BMSC并進行GFP基因轉(zhuǎn)染標記，目的是以近交系版納微型豬為實驗動物開展后續(xù)體內(nèi)實驗研究。本研究結(jié)果提示：只要篩選確定了慢病毒使用最佳劑量，GFP的轉(zhuǎn)染不會影響p BMSC成脂分化的生物學特性，與h UCMSC等種屬來源細胞一樣，來自于近交系版納微型豬的p BMSC也不例外，慢病毒轉(zhuǎn)染標記GFP可以用于體內(nèi)示蹤實驗研究。
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