成纖維細胞生長因子14為FGF家族成員之一,主要表達于中樞神經(jīng),其基因突變與神經(jīng)系統(tǒng)異常疾病緊密相關(guān),但目前關(guān)于FGF14與相關(guān)疾病及其作用機制方面的研究尚處于起始階段。因此,本研究通過基因工程技術(shù)克隆FGF14基因片段、構(gòu)建工程菌株及在大腸桿菌中的表達、純化工藝研究,并研究FGF14蛋白對NIH3T3、PC12細胞促增殖活性及對Aβ_(25-35)誘導PC12細胞建立阿爾茲海默癥模型的神經(jīng)保護作用。本課題的研究結(jié)果如下:FGF14基因片段與pET15b表達載體連接形成重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到感受態(tài)BL21(DE3)中,將重組FGF14蛋白在大腸桿菌表達體系中高密度表達。通過超聲破碎方法破碎菌體使目的蛋白釋放,經(jīng)SDS-PAGE方法驗證得出FGF14蛋白大部分以包涵體形式表達。通過包涵體清洗、鹽酸胍變性,采用稀釋復性方法使蛋白恢復其正常的空間結(jié)構(gòu),再通過表達載體具有組氨酸標簽與鎳柱特異性親和特性進行純化獲得較高純度FGF14蛋白。表達純化工程化技術(shù)的建立為FGF14蛋白應用和機制研究提供了保障。選擇NIH3T3、PC12細胞利用CCK8的方法檢測FGF14蛋白促增殖生物學活性。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)在無肝素存在條件下FGF14蛋白對NIH3T3、PC12細胞促增殖活性不明顯或無促增殖活性,而FGF14在與一定濃度肝素結(jié)合的條件下在PC12細胞中具有了明顯的促增殖活性。活性檢測方法的建立為FGF14蛋白的定性和定量提供了重要依據(jù)。利用Aβ_(25-35)損傷PC12細胞研究FGF14蛋白對神經(jīng)保護作用。采用Aβ_(25-35)損傷濃度為40μmol/L、作用時間為48 h,成功構(gòu)建神經(jīng)損傷模型;通過劑量摸索發(fā)現(xiàn)FGF14蛋白在4~16 ng/mL濃度范圍內(nèi),減輕Aβ_(25-35)導致的神經(jīng)損傷呈現(xiàn)出劑量依賴性,同時在該濃度范圍內(nèi)能夠顯著抑制LDH、MDA的釋放,證明FGF14蛋白對PC12細胞具有神經(jīng)保護作用。利用熒光以及流式的技術(shù)方法同樣證明FGF14蛋白具有較好的神經(jīng)保護作用。進一步,利用Western Blot技術(shù)證明FGF14蛋白是通過MAPK信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
【學位單位】：溫州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q42;R336
【部分圖文】：

第三章 結(jié)果和分析GF 家族中一員，對于 FGF 各成員的作用是研究桿菌體系中進行表達、純化，并檢測 FGF14 的鑒定及序列分析C-hFGF14 質(zhì)粒和 pET-15b 載體通過 Nde I 和14 以及載體 pET-15b 片段，在連接酶作用下以感受態(tài) E. Coli DH5α 感受態(tài)細胞中，隨機挑取相質(zhì)粒，該質(zhì)粒經(jīng) Nde I 和 BamH I 雙酶切切出 Fp，載體 pET-15b 片段大小約為 5700bp，與預準確插入到表達載體 pET-15b 中。將篩選出的果與設(shè)計預期完全相同，基因、氨基酸、載體

白表達及條件優(yōu)化組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到表達載體 BL21(DE3)中，通過小錐形瓶的表達實驗將 以 1 mmol/L 的終濃度在 37 ℃下誘導 4 h，收集樣品在 12%中進行分析。結(jié)果顯示如圖 3-2a，1 為誘導前電泳條帶，2~6 分別導后電泳條帶，誘導后和誘導前相比有明顯的蛋白表達條帶。通過析，利用 hFGF14 單克隆抗體鑒定出誘導蛋白為 hFGF14 如圖 3-2b。選出的高表達菌株作為菌種，將高表達菌株的菌種在 2 L 的大三大培養(yǎng)，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度為一代種子培養(yǎng)條件是 37 ℃，至 A600值達到 0.8~1.0；二代種子培養(yǎng)條件為 37 ℃，180 rpm 培養(yǎng)值達到3~5時轉(zhuǎn)至2 L大搖瓶中擴大培養(yǎng)，待菌液A600值為0.8~1.0劑 IPTG 終濃度為 1 mmol/L。溫度為 32 ℃，180 rpm 培養(yǎng) 4 h，加間隔 1 h 分別取樣，如圖 3-2c 結(jié)果顯示在 2 L 大搖瓶擴大培養(yǎng)成功 蛋白。溫度為 18 ℃，180 rpm 培養(yǎng) 24 h，加入誘導劑后每間隔 8 h圖 3-2d 結(jié)果顯示在 2 L 大搖瓶擴大培養(yǎng)成功誘導出 FGF14 蛋白。

GF14 重組蛋白誘導表達的 12%(v/v) SDS-P~5：不同菌株經(jīng) IPTG 誘導后；M：蛋白質(zhì)DS-PAGE analysis of FGF14 recombinant pron; Lane 2,3,4 and 5: induction FGF14 protein iogalactopyranoside (IPTG) ; lane M: molecu
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 范翠英;馮利興;樊金玲;果德安;劉璇;;重組蛋白表達系統(tǒng)的研究進展[J];生物技術(shù);2012年02期

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本文編號：2847442