前言寄生蟲學是一門以形態(tài)學研究為主的學科,依靠顯微鏡進行形態(tài)學檢查的傳統(tǒng)分類鑒定方法已經(jīng)滿足不了日趨復雜多樣的寄生蟲進化、種屬分類以及流行病學研究。分子生物學方法的引入,使得分子寄生蟲學(Molecular Parasitology)得到了長足的發(fā)展,目前已成為現(xiàn)代寄生蟲學最重要的學科分支和學科研究的前沿領域。應用分子寄生蟲學方法,可從基因水平對寄生蟲進行種屬鑒定與分類,從分子水平認識寄生現(xiàn)象,探討寄生蟲入侵宿主的分子機制,尋找抗寄生蟲藥物的分子靶標,分離和鑒定診斷用特異性抗原分子和疫苗候選抗原分子,以解決寄生蟲病的診斷、治療和預防等問題。目前,用于研究寄生蟲種屬鑒定與分類的基因有多種,包括核DNA、線粒體DNA、動基體DNA和質(zhì)體DNA等,其中線粒體DNA(cytb、cox1、cox3、nad1、nad4等)及核糖體DNA(ITS1、ITS2、rrnS等)已被廣泛應用于對寄生蟲遺傳結(jié)構(gòu)及親緣關系的分析研究中。特別是線粒體DNA因具有分子較小、結(jié)構(gòu)簡單、進化速率高和母性遺傳等特點,尤其適合作為遺傳學研究的標記,其中細胞色素C氧化酶第Ⅰ亞基(cox1)基因已被廣泛認可,應用于猬迭宮絳蟲遺傳變異的研究中。Milad等通過cox1基因比對分析,證實伊朗1例貓源裂頭蚴為猬迭宮絳蟲;Simpson等應用cox1基因分析發(fā)現(xiàn)澳大利亞1例狗源裂頭蚴為虛假迭宮絳蟲;Jeon等用多重PCR和cox1基因測序方法研究了中國和韓國兩國蛇源裂頭蚴,結(jié)果表明全部共904條裂頭蚴樣本都歸屬于虛假迭宮絳蟲;Jeon等最近通過形態(tài)學和部分cox1基因鑒定了韓國人體裂頭蚴病的病原體有猬迭宮絳蟲和虛假迭宮絳蟲;Tang等通過cox1基因和28S rRNA基因鑒定,對9例香港人裂頭蚴進行回顧性分析,9個樣品均被確認為猬迭宮絳蟲。截至目前,確認能感染人的裂頭蚴有猬迭宮絳蟲和虛假迭宮絳蟲,韓國已有以上兩種蟲種的報道。我國迄今僅有猬迭宮絳蟲一種報道,其中遼寧和湖北兩地裂頭蚴的報道僅限于人體病例報告或動物感染率檢測,尚缺乏基因分析及確切的蟲種鑒定依據(jù),是歸屬于猬迭宮絳蟲還是虛假迭宮絳蟲?是否與地理位置相近的韓國分離株基因型一致?目前確定能引起人體感染的吸吮線蟲有三種,即結(jié)膜吸吮線蟲(T.callipaeda)、加里福尼亞吸吮線蟲(T.californiensis)和最近發(fā)現(xiàn)的大口吸吮線蟲(T.gulosa),不同種屬的吸吮線蟲在蟲體形態(tài)、地域分布方面存在差異。中國是吸吮線蟲病報道最多的國家,報告病例數(shù)近千例,且只有結(jié)膜吸吮線蟲一種。此前的病例報告主要依據(jù)形態(tài)學特征或臨床癥狀進行診斷,不能反應出因受環(huán)境因素(自然、地理、氣候等)長期影響,不同種株間產(chǎn)生的遺傳進化關系間的區(qū)別,而通過DNA序列分析來鑒定寄生蟲蟲種和遺傳變異情況則彌補了形態(tài)學分析的不足。本研究選用了cox1基因為分子標記,對裂頭蚴及結(jié)膜吸吮線蟲進行了基因鑒定,并分別對兩種寄生蟲的親緣關系進行分析,首次明確了我國遼寧和湖北兩地流行的人源和蛙源裂頭蚴的基因型,獲得的資料對兩種少見寄生蟲病的流行病學調(diào)查具有重要意義,為該裂頭蚴病及結(jié)膜吸吮線蟲病的種屬分類、鑒別診斷、預防控制等更深入的研究奠定基礎。研究方法一、形態(tài)學檢查1、將蟲體置于含生理鹽水的平皿中,觀察蟲體的大體形態(tài),顯微鏡下觀察微細結(jié)構(gòu)。2、再行HE/鹽酸卡紅染色,觀察各部位的解剖結(jié)構(gòu)、組織學特征,之后將蟲體于75%乙醇溶液4℃保存。二、基因測序1、蟲體DNA提取:從保存液中取出蟲體,用組織剪剪碎,然后用SDS/蛋白激酶K(20mg/mL,20μL)消化,常規(guī)酚氯仿法提取基因組DNA,加入TE緩沖液,-20℃保存。2、擴增目的片段:以cox1基因為分子標記,查閱文獻選取引物,PCR擴增得到目的片段。3、基因測序:取擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳觀察目的條帶,并送上海生工生物有限公司進行基因測序。三、測序結(jié)果的分析及比對1、采用ContigExpress軟件對獲得的序列進行拼接,然后經(jīng)BioEdit軟件進行人工校正,用BLAST軟件與基因庫中文獻進行同源性比較。2、結(jié)合GenBank中已登錄的同科蟲種線粒體cox1基因信息,應用DNAStar軟件進行多重序列比對,了解其種間及種內(nèi)變異情況。四、系統(tǒng)發(fā)育分析選取GenBank中部分同科蟲種線粒體cox1基因,利用MEGA7.0軟件以最大簡約法(Maximum Parsimony,MP)、鄰接法(Neighbor Joining method,NJ)及最大似然樹(Maximum Likelihood,ML)繪制種系發(fā)育樹,自展值(Bootstrap)重復抽樣1000次。結(jié)果一、形態(tài)學鑒定結(jié)果1、7例裂頭蚴長9.8cm~15.1cm、寬為0.3cm~0.4cm,活蟲體為乳白色,不分節(jié),但具橫紋,活體伸縮活動能力強;蟲體頭部具有吸槽,體部具有排列不規(guī)則的橫皺褶,體腔內(nèi)的石灰小體和細行的肌束,初步鑒定為曼氏迭宮絳蟲。2、2例結(jié)膜吸吮線蟲外觀細長呈線狀、乳白色、半透明,成蟲頭端及尾端圓鈍,蟲體表面具有明顯的鋸齒狀橫紋,前端有一典型的六角形梯狀口腔,支持其形態(tài)學診斷。二、基因鑒定結(jié)果1、遼寧與湖北7例蟲體經(jīng)巢式PCR擴增均得到大小為390bp的cox1基因片段,BLAST同源性分析結(jié)果顯示與歐猬迭宮絳蟲(KJ599680.1)同源(97%~99%),與虛假迭宮絳蟲(KJ599679.1)、S.ranarum差異明顯(12%~13%)。DNAStar軟件分析7個蟲體間cox1基因一致性97%~100%,人源及蛙源cox1基因之間沒有明顯差別(1%~3%),兩地cox1基因之間沒有明顯差別(0~2%),而與裂頭屬的種間差異較大為(12%~29%)。2、遼寧1例與山東1例蟲體擴增均得到大小為689bp的cox1基因片段,BLAST同源性分析的結(jié)果顯示與結(jié)膜吸吮線蟲線粒體全基因組的一致性(Similarity Index)均為99%;2例標本一致性為98.3%,13個堿基突變位點(G/A位于89、149、206、221、236、467、473、608;C/T位于39、47、225、401、539)。三、系統(tǒng)發(fā)育分析1、應用MP法、NJ法與ML法構(gòu)建種系發(fā)育樹拓撲結(jié)構(gòu)基本一致,僅在自展值有所差異,遼寧分離株(LNZH1、LNDD1、LNJZ1及LNJZ2)和湖北分離株(HBXG1、HBHH1及HBXN1)具有高度同源性,與韓國貓源分離(KJ599680.1)位于同一分枝,與其他絳蟲所屬分支相隔較遠。2、遼寧人源結(jié)膜吸吮線蟲與意大利犬源(AM042555.1)屬于同一分支,與歐洲株同源,且2例標本一致性為99.1%,6個堿基突變位點(G/T位于8;G/A位于311、468;C/T位于39、47、401);山東人源結(jié)膜吸吮線蟲與羅馬尼亞犬源(KP087796.1)、斯洛伐克犬源(KY476400.1)、匈牙利貓源(KX372681.1)及塞爾維亞貓源(KJ433983.1)屬于同一大分支,亦與歐洲株同源,一致性為99.6%,3個堿基突變位點(G/T位于8;G/A位于221、257)。結(jié)論1、遼寧及湖北兩地7例疑似裂頭蚴分離株經(jīng)形態(tài)學和基因型分析均被確定為歐猬迭宮絳蟲(S.erinaceieuropaei)。2、遼寧及山東兩地2例疑似結(jié)膜吸吮線蟲分離株經(jīng)形態(tài)學和基因型分析均被確定為結(jié)膜吸吮線蟲。3、系統(tǒng)發(fā)育分析表明遼寧及湖北裂頭蚴分離株(人源、蛙源)與韓國貓源分離株(KJ599680.1)位于同一分枝,與韓國犬源分離株(KJ599679.1)相對較遠,第一次明確了兩個地區(qū)裂頭蚴基因型。4、遼寧及山東兩地人源結(jié)膜吸吮線蟲與歐洲動物源分離株同源,與本課題組既往研究結(jié)果一致。5、不同地域、宿主來源的cox1基因種內(nèi)保守,種間存在不同程度的變異,驗證了其可作為寄生蟲的分子診斷標記。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R383
【部分圖文】：

3.1 形態(tài)學鑒定結(jié)果3.1.1 肉眼觀察裂頭蚴蟲體大小平均為：長9.8cm～15.1cm，寬0.3cm～0.4cm（見圖1）。測得7條蟲體的長、寬見表6。表 6. 裂頭蚴的蟲體長度與寬度LNDD1 LNZH1 LNJZ1 LNJZ2 HBXG1 HBHH1 HBXN1長（cm） 10.2 9.8 13.9 14.8 11.7 15.1 14.4寬（cm） 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.4 0.43.1.2 顯微鏡下觀察普通光學顯微鏡下可見蟲體頭部具有吸槽，體部具有排列不規(guī)則的橫皺褶，尾部鈍圓（見圖 2）。圖 1 肉眼觀察蟲體的大體形態(tài)。 圖 2 顯微鏡下蟲體的形態(tài)特征（100X）。

條蟲體的長、寬見表6。表 6. 裂頭蚴的蟲體長度與寬度LNDD1 LNZH1 LNJZ1 LNJZ2 HBXG1 HBHH1 HBXN1長（cm） 10.2 9.8 13.9 14.8 11.7 15.1 14.4寬（cm） 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.4 0.43.1.2 顯微鏡下觀察普通光學顯微鏡下可見蟲體頭部具有吸槽，體部具有排列不規(guī)則的橫皺褶，尾部鈍圓（見圖 2）。

凹凸不平的皺褶、皮層致密嗜伊紅深染、實質(zhì)組織中的石灰小體和嗜伊紅著色的縱向細條狀的肌纖維（圖 3，圖 4）。圖3 蟲體頭部，顯示縱裂的吸槽。a: 皮層致密嗜伊紅深染 b:皺褶 c:肌纖維（HE染色100X）。圖4 裂頭蚴的體部，蟲體橫切面顯示d:石灰小體（HE染色400X）。
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本文編號：2845832