發(fā)布時(shí)間：2020-10-18 12:51

　　 目的:幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一種重要的致病菌,具有很高的感染性,全球的感染率達(dá)到了50%。CagL蛋白是HP的一種伴侶蛋白,是HPⅣ型分泌系統(tǒng)的一種表面蛋白,由hp0539基因序列編碼,在啟動(dòng)異常細(xì)胞通路引起病理性的臨床改變上都起到了重要的作用。本實(shí)驗(yàn)利用CagL單克隆抗體和多克隆抗體,建立了可用于檢測(cè)人糞便樣品中的CagL抗原的雙抗體夾心ELISA方法,制備并組裝了試劑盒,為檢測(cè)HP的感染提供了有效工具。方法:本實(shí)驗(yàn)制備了兔源CagL多克隆抗體,利用CagL單克隆抗體作為一抗包被酶標(biāo)板,并進(jìn)行封閉,兔源CagL多克隆抗體作為二抗,再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗家兔IgG抗體與二抗進(jìn)行反應(yīng),通過加入底物顯色以檢測(cè)樣品中是否含有CagL抗原。采用棋盤方陣滴定法,確定一抗的最佳包被濃度及二抗和酶標(biāo)抗體的最佳稀釋度,從而使抗原抗體進(jìn)行更充分的反應(yīng)。并且對(duì)初步制成的試劑盒進(jìn)行敏感性、特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性測(cè)試,判斷試劑盒是否研制成功。結(jié)果:采用棋盤滴定法確定一抗的最佳包被濃度為0.048μg/mL,二抗和酶標(biāo)抗體的最佳稀釋度分別為1:32000和1:4000。試劑盒的敏感性試驗(yàn)表明:該方法判讀的最低蛋白濃度為9.75μg/ml;特異性試驗(yàn):表明該方法的特異性較好,不與糞便中的其他菌群發(fā)生交叉反應(yīng);重復(fù)性試驗(yàn):對(duì)10份檢測(cè)樣品進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn),結(jié)果顯示批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)性均較好,批內(nèi)變異系數(shù)在1.65%~10.5%之間,批間變異系數(shù)在1.3%~9.35%之間,基本滿足變異系數(shù)小于10%,說明該試劑盒的重復(fù)性良好;穩(wěn)定性試驗(yàn):將包被好的酶標(biāo)板分別存于37℃和4℃放置105d,每隔15d取出試劑盒對(duì)相同樣本進(jìn)行檢測(cè),觀測(cè)其吸光度值的變化。結(jié)果表明該試劑盒在105d內(nèi)檢測(cè)P/N值均大于2.1滿足了該試劑盒的判斷標(biāo)準(zhǔn)。以上結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)所建立的CagL雙抗體夾心ELISA抗原檢測(cè)方法基本滿足敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),可進(jìn)一步應(yīng)用于臨床研究。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392-33
【部分圖文】：

幽門螺桿菌cag致病島區(qū)域示意圖

CagL蛋白帶狀模型圖

多克隆抗體的WesternBlot驗(yàn)證Fig.2.1WesternBlotverificationofpolyclonalantibodies
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2846325