目的:幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一種重要的致病菌,具有很高的感染性,全球的感染率達到了50%。CagL蛋白是HP的一種伴侶蛋白,是HPⅣ型分泌系統(tǒng)的一種表面蛋白,由hp0539基因序列編碼,在啟動異常細胞通路引起病理性的臨床改變上都起到了重要的作用。本實驗利用CagL單克隆抗體和多克隆抗體,建立了可用于檢測人糞便樣品中的CagL抗原的雙抗體夾心ELISA方法,制備并組裝了試劑盒,為檢測HP的感染提供了有效工具。方法:本實驗制備了兔源CagL多克隆抗體,利用CagL單克隆抗體作為一抗包被酶標板,并進行封閉,兔源CagL多克隆抗體作為二抗,再加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗家兔IgG抗體與二抗進行反應(yīng),通過加入底物顯色以檢測樣品中是否含有CagL抗原。采用棋盤方陣滴定法,確定一抗的最佳包被濃度及二抗和酶標抗體的最佳稀釋度,從而使抗原抗體進行更充分的反應(yīng)。并且對初步制成的試劑盒進行敏感性、特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性測試,判斷試劑盒是否研制成功。結(jié)果:采用棋盤滴定法確定一抗的最佳包被濃度為0.048μg/mL,二抗和酶標抗體的最佳稀釋度分別為1:32000和1:4000。試劑盒的敏感性試驗表明:該方法判讀的最低蛋白濃度為9.75μg/ml;特異性試驗:表明該方法的特異性較好,不與糞便中的其他菌群發(fā)生交叉反應(yīng);重復(fù)性試驗:對10份檢測樣品進行重復(fù)檢驗,結(jié)果顯示批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)性均較好,批內(nèi)變異系數(shù)在1.65%~10.5%之間,批間變異系數(shù)在1.3%~9.35%之間,基本滿足變異系數(shù)小于10%,說明該試劑盒的重復(fù)性良好;穩(wěn)定性試驗:將包被好的酶標板分別存于37℃和4℃放置105d,每隔15d取出試劑盒對相同樣本進行檢測,觀測其吸光度值的變化。結(jié)果表明該試劑盒在105d內(nèi)檢測P/N值均大于2.1滿足了該試劑盒的判斷標準。以上結(jié)果表明,本實驗所建立的CagL雙抗體夾心ELISA抗原檢測方法基本滿足敏感性高、特異性強、穩(wěn)定性好等優(yōu)點,可進一步應(yīng)用于臨床研究。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392-33
【部分圖文】：

幽門螺桿菌cag致病島區(qū)域示意圖

CagL蛋白帶狀模型圖

多克隆抗體的WesternBlot驗證Fig.2.1WesternBlotverificationofpolyclonalantibodies
【參考文獻】

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本文編號：2846325