轉(zhuǎn)錄因子c-Myb是造血過程中非常重要的調(diào)節(jié)因子,在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮著重要的作用。c-myb在造血祖細(xì)胞中表達(dá)量很高,隨著細(xì)胞的分化,它的表達(dá)量會(huì)降低甚至?xí)槐磉_(dá)。近期關(guān)于c-myb的異常表達(dá)會(huì)引發(fā)各種癌癥,如白血病,乳腺癌,結(jié)腸癌的報(bào)道引起了人們的高度重視。盡管有很多報(bào)道闡述了關(guān)于c-myb表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究,但是由于c-myb缺乏典型的啟動(dòng)子并且有多種因子參與其中,因此了解c-myb的詳細(xì)轉(zhuǎn)錄機(jī)制仍有很多疑問有待解決。有多項(xiàng)研究證明遠(yuǎn)端調(diào)控元件在c-myb表達(dá)調(diào)控中具有非常重要的作用,但是其詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制尚不明了。實(shí)驗(yàn)室前期數(shù)據(jù)表明,在小鼠骨髓白血病M1細(xì)胞中,c-myb的啟動(dòng)子上游25kb、50kb、70kb三個(gè)區(qū)域存在DNA調(diào)控元件與c-myb的啟動(dòng)子有互作,通過DNA-loop空間結(jié)構(gòu)靠近c(diǎn)-myb基因啟動(dòng)子區(qū),激活基因的表達(dá)并且誘發(fā)腫瘤的發(fā)生,同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Hoxa9、PU.1等可以通過結(jié)合這些遠(yuǎn)端元件來調(diào)控c-myb的轉(zhuǎn)錄,這一發(fā)現(xiàn)為研究白血病提供了新的思路,因此我們想進(jìn)一步了解在人類白血病中是否有類似的遠(yuǎn)距離調(diào)控元件以及這些調(diào)控元件是如何調(diào)控c-myb的轉(zhuǎn)錄。隨后我們在人的白血病細(xì)胞系K562中,使用環(huán)狀染色體構(gòu)象捕獲(4C)的方法,以人類6號(hào)染色體c-myb基因的啟動(dòng)子為誘餌,發(fā)現(xiàn)了上游34k、88k兩個(gè)與promoter啟動(dòng)子互作強(qiáng)的位點(diǎn),證實(shí)了這兩個(gè)上游遠(yuǎn)端調(diào)控元件可能會(huì)調(diào)控c-myb基因的表達(dá)。雙熒光報(bào)告系統(tǒng)分析結(jié)果進(jìn)一步表明了-34k、-88k的增強(qiáng)子活性,并且我們在這些區(qū)域發(fā)現(xiàn)了表觀修飾H3K27ac的富集以及轉(zhuǎn)錄因子GATA1,TAL1的結(jié)合,因此我們猜測這些轉(zhuǎn)錄因子可能會(huì)參與c-myb的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。基于以上的研究基礎(chǔ),我們想進(jìn)一步了解這些遠(yuǎn)端調(diào)控元件以及表觀修飾和轉(zhuǎn)錄因子是如何調(diào)控c-myb基因的。在本研究中,我們繼續(xù)以人類紅白血病細(xì)胞系K562為模型,研究位于人類6號(hào)染色體上的c-myb基因-34k、-88k的表觀修飾以及轉(zhuǎn)錄因子對基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響,我們用鐵血紅素(hemin)誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化后通過染色質(zhì)免疫共沉淀(Ch IP-q PCR)的方法檢測-34k、-88k區(qū)域的組蛋白H3K27ac以及轉(zhuǎn)錄因子GATA1、TAL1的富集情況,同時(shí)我們構(gòu)建了靶向c-myb上游34k、88k的g RNA,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)攜帶相應(yīng)的表觀修飾酶類對遠(yuǎn)距離調(diào)控區(qū)域進(jìn)行表觀修飾,檢測激活和抑制性表觀修飾對c-myb表達(dá)的影響,最后我們將dCas9-p300和增強(qiáng)子g RNA共轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞中,監(jiān)測hemin誘導(dǎo)細(xì)胞分化后c-myb的表達(dá)情況,結(jié)果如下:1)鐵血紅素(hemin)誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化24小時(shí)后,c-myb基因遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)域-34k、-88k的組蛋白修飾H3K27ac富集度降低,轉(zhuǎn)錄因子GATA1、TAL1的富集度也降低2)成功構(gòu)建了靶向人類紅白血病細(xì)胞系K562第6號(hào)染色體上c-myb基因promoter,-34k,-88k,-53k的g RNA(promoter為陽性對照,-53k為陰性對照),生工測序結(jié)果表明所有的g RNA已經(jīng)成功克隆到p SPg RNA空載體質(zhì)粒上,沒有突變。3)ChIP-qPCR結(jié)果顯示,dCas9-p300可成功靶標(biāo)到-34k、-88k區(qū)域且增加這些區(qū)域的H3K27ac水平。4)dCas9-p300靶向c-myb基因-34k區(qū)域后提高了該區(qū)域的H3K27ac并且結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子GATA1、TAL1激活c-myb基因的表達(dá);dCas9-p300靶向c-myb基因-88k區(qū)域后提高了該區(qū)域H3K27ac并且結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子GATA1激活c-myb基因的表達(dá)。5)ChIP-qPCR結(jié)果顯示,dCas9-DNMT3A可成功靶標(biāo)到-34k區(qū)域且增加該區(qū)域的DNA甲基化水平。6)dCas9-DNMT3A靶向c-myb基因-34k區(qū)域后提高了DNA甲基化水平抑制了cmyb基因的表達(dá)7)dCas9-p300靶向遠(yuǎn)端增強(qiáng)子后可以在一定程度上降低k562細(xì)胞分化以上所有的結(jié)果表明,在人類紅系白血病K562中,hemin誘導(dǎo)細(xì)胞分化后,組蛋白H3K27ac和轉(zhuǎn)錄因子GATA1、TAL1等的富集度降低。在c-myb基因上游存在遠(yuǎn)距離調(diào)控元件-34k區(qū)域作為一個(gè)增強(qiáng)子,當(dāng)乙酰轉(zhuǎn)移酶dCas9-p300靶向該區(qū)域增加組蛋白H3K27ac后,結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子GATA1、TAL1激活c-myb基因的表達(dá),而甲基轉(zhuǎn)移酶dCas9-DNMT3A靶向該區(qū)域增加DNA甲基化后可抑制c-myb基因的表達(dá)。-88k區(qū)域作為一個(gè)增強(qiáng)子,乙酰轉(zhuǎn)移酶dCas9-p300靶向該區(qū)域增加組蛋白H3K27ac后,結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子GATA1激活c-myb基因的表達(dá)。本次研究證明了這些遠(yuǎn)距離調(diào)控元件表觀修飾后可以影響c-myb基因的表達(dá),同時(shí)dCas9-p300靶向遠(yuǎn)端增強(qiáng)子后可以在一定程度上降低k562細(xì)胞分化,因此這些調(diào)控位點(diǎn)可以作為一個(gè)藥物靶標(biāo),為進(jìn)一步研究白血病提供一個(gè)新的突破點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

1c-myb的結(jié)構(gòu)

區(qū)域的增強(qiáng)子形成了一個(gè)包含Myb啟動(dòng)子和第一個(gè)內(nèi)含子的活性染色質(zhì)中心(ACH),結(jié)合了CTCF，GATA1/TAL1/LDB1等轉(zhuǎn)錄因子，隨著紅細(xì)胞分化后ACH不穩(wěn)定，Myb表達(dá)下調(diào)[39]（圖1.1.3.2）。圖1.1.3.2 MYB在紅系細(xì)胞分化模型中的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模型[39]Figure 1.1.3.2 Dynamic transcriptional regulation model of MYB in erythroid cell differentiation

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文4圖1.1.3.1：逆轉(zhuǎn)錄病毒整合區(qū)域與腫瘤細(xì)胞中c-myb的5末端長區(qū)域相互作用的模型[37]Figure 1.1.3.1:A model for interaction between the retroviral integrationregion and the 5-terminal long region of c-myb in tumor cells1.1.3.2 c-myb 與轉(zhuǎn)錄因子c-Myb的轉(zhuǎn)錄因子在造血祖細(xì)胞中均會(huì)表達(dá)的，在造血系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要的作用[17]。近期相關(guān)研究顯示，一些造血轉(zhuǎn)錄因子TF可與HBS1L-Myb基因間區(qū)的增強(qiáng)因子結(jié)合，進(jìn)一步來控制著基因的表達(dá)[37]。有研究表明，紅細(xì)胞發(fā)育受一系列TF控制，包括GATA1，LDB1，TAL1
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本文編號(hào)：2845301