目的:探討LAMTOR1在小鼠β細(xì)胞胰島素分泌中的作用及其分子機(jī)制。方法:以C57小鼠為背景構(gòu)建LAMTOR1胰島特異性敲除(β-LAMTOR1-KO)小鼠模型,通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證小鼠胰島LAMTOR1基因的敲除。在體內(nèi)通過(guò)腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)和高葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠β細(xì)胞功能;利用胰島灌注、線粒體功能分析和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)研究探討LAMTOR1在胰島素分泌途徑中的作用機(jī)制。結(jié)果:與對(duì)照組小鼠相比,葡萄糖耐量試驗(yàn)顯示β-LAMTOR1-KO組小鼠葡萄糖水平更低,高葡萄糖鉗夾和胰島灌注實(shí)驗(yàn)過(guò)程中β-LAMTOR1-KO組胰島素分泌水平顯著升高。β-LAMTOR1-KO組小鼠胰島細(xì)胞的線粒體功能障礙,但LAMTOR1缺失卻增加了胰島素顆粒中谷氨酸含量以及乙酰輔酶A羧化酶1(acetyl-CoA carboxylase 1,ACC1)活性,最終導(dǎo)致β細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素分泌增加。結(jié)論:LAMTOR1對(duì)于維持胰腺β細(xì)胞的線粒體功能是重要的。盡管LAMTOR1的缺乏會(huì)損害胰島β細(xì)胞線粒體功能從而導(dǎo)致胰島素分泌的觸發(fā)途徑受損,但通過(guò)增加谷氨酸和ACC1代謝引起的擴(kuò)增途徑補(bǔ)償了觸發(fā)途徑的缺陷并最終導(dǎo)致葡萄糖刺激的胰島素分泌增加。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R587.1;R-332
【部分圖文】：

第 2 章 探討 LAMTOR1 在 β 細(xì)胞胰島素分泌中的作用及其機(jī)制研究-ACC 單克隆抗體 美國(guó) CST 公司CC 單克隆抗體 美國(guó) CST 公司sp90 單克隆抗體 英國(guó) abcam 公司過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG+L）美國(guó) CST 公司過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG+L）美國(guó) CST 公司 實(shí)驗(yàn)方法1 LAMTOR1 胰島特異性敲除（β-LAMTOR1-KO）小鼠的構(gòu)建以C57小鼠為背景設(shè)計(jì)獲得LAMTOR1-floxed小鼠（南京模式動(dòng)物研究建策略如圖1所示，將所得純和小鼠與胰島特異性表達(dá)Cre重組酶的Ri進(jìn)行雜交，進(jìn)一步得到帶有 Cre 的純和 LAMTOR1-floxed 小鼠，AMTOR1-KO 小鼠。

[U-C]-Glucose ； E 組 ： LAMTOR1-floxed 小 鼠 胰 島 + ]-Glucose；F 組：LAMTOR1-floxed 小鼠胰島+ 16.7mM [U-13C]-G GLP-1。按照上述分組，將小鼠胰島細(xì)胞置于 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 33）采用 OptiPrep 密度梯度離心法分離胰島 β 細(xì)胞的胰島素顆粒，胰島素顆粒中谷氨酸的 C13富集水平。果建 β 細(xì)胞特異性 LAMTOR1 基因敲除小鼠了探討 LAMTOR1 在胰腺 β 細(xì)胞中的作用及其機(jī)制，我們通TOR1-floxed（LAMTOR1F/F）純合小鼠與 RIP-Cre 小鼠雜交產(chǎn)生 βLAMTOR1 敲除小鼠（β-LAMTOR1-KO）。通過(guò)蛋白印跡分析，我AMTOR1-KO 小鼠原代胰島細(xì)胞基因組 DNA 中 floxed 序列的缺失（MTOR1F / F 小鼠（同窩小鼠）相比，β-LAMTOR1-KO 小鼠的胰島測(cè)不到 LAMTOR1 蛋白的表達(dá)。

第 2 章 探討 LAMTOR1 在 β 細(xì)胞胰島素分泌中的作用及其機(jī)制研究2.2 LAMTOR1 缺失對(duì)胰島 β 功能的影響對(duì)10周齡β-LAMTOR1-KO和LAMTOR1F/F雄性小鼠進(jìn)行體內(nèi)腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)，比較分析顯示與 LAMTOR1 F/F 組小鼠相比，β-LAMTOR1-KO 組小鼠的葡萄糖水平更低（圖 3A）。如前所述，胰腺 β 細(xì)胞在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而葡萄糖刺激的胰島素分泌對(duì)于維持 β 細(xì)胞的正常生理功能至關(guān)重要[19]。因此，我們進(jìn)一步分析 LAMTOR1 缺失是否對(duì)小鼠 β 細(xì)胞功能有影響。我們利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Q-PCR）以確定幾種相關(guān)基因的 mRNA 表達(dá)，包括 PDX1，INS2，GLUT2 和 GCK，其中 PDX1 和 INS2 是胰島素生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，GLUT2 和 GCK 分別與葡萄糖攝取和葡萄糖代謝相關(guān)[20]。結(jié)果表明這些基因的 mRNA 表達(dá)水平在兩組之間相似（圖 3B）。此外，對(duì)于禁食或喂食的小鼠，β-LAMTOR1-KO 和 LAMTOR1 F/F 組之間胰腺中總胰島素含量沒(méi)有差異（圖 3C）。這些結(jié)果表明，β-LAMTOR1-KO 組中 β 細(xì)胞功能改善可能是由于葡萄糖刺激的胰島素分泌的增強(qiáng)導(dǎo)致的。
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本文編號(hào)：2845050