目的·基于小鼠脾紅髓巨噬細胞唾液酸黏附蛋白(sialoadhesin,Sn)即CD169分子的表達水平,研究CD169~(+ )和CD169~-紅髓巨噬細胞亞群的基因表達譜差異。方法·采用流式細胞術和免疫熒光法檢測C57BL/6J野生型(WT)小鼠脾紅髓巨噬細胞中CD169的表達,以CD169敲除(CD169 KO)小鼠為陰性對照。富集F4/80~+的脾紅髓巨噬細胞并分選出CD169~(+ )和CD169~-2個亞群,進行RNA測序。利用DESeq2軟件以P0.05且|log_2FC|≥1為條件篩選出差異表達基因,通過京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes,KEGG)功能分析,將差異基因按照參與的通路或功能進行分類。通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)驗證部分差異基因。結果·流式細胞術和免疫熒光法證實部分紅髓巨噬細胞表達CD169。CD169~+ 和CD169~-亞群擁有485個差異表達基因。一些與介導炎癥相關的基因在CD169~-亞群中高表達。結論·CD169~(+ )和CD169~-紅髓巨噬細胞有不同的轉錄譜,CD169~-紅髓巨噬細胞亞群具有更多M1型巨噬細胞的特征。
【部分圖文】：

為了驗證野生型(wild type,WT)小鼠部分RpMΦ表達CD169分子,本研究先利用流式細胞術檢測WT小鼠和CD169 KO小鼠脾中RpMΦ的比例,再比較RpMΦ中CD169分子的表達情況。根據(jù)已有的研究[22-23]表明,F4/80+ CD11b-可作為RpMΦ的表面標志物。因此,如流式細胞術策略(圖1A)所示,在圈選了脾細胞并去黏連后,F4/80+ CD11b-細胞群即為RpMΦ。結果顯示,CD169 KO小鼠脾內(nèi)RpMΦ的比例與WT小鼠相似(圖1B),2組小鼠RpMΦ占脾細胞的比例均在0.5%～1.5%,差異無統(tǒng)計學意義(圖1C);但以CD169 KO小鼠作為陰性對照,在WT小鼠RpMΦ中可明顯地觀察到部分RpMΦ表達CD169分子(圖1B、D)。2.2 CD169+ RpMΦ的空間分布

為進一步確認CD169在小鼠脾RpMΦ中的表達,本研究利用免疫熒光技術對脾RpMΦ上CD169表達情況進行檢測,結果(圖2)顯示,在白色虛線內(nèi)側邊緣(邊緣區(qū))存在一圈高表達CD169(紅色)的MMMΦ;在脾紅髓中CD169呈散在分布,并與部分F4/80+的RpMΦ有很好的共定位。由此再次證實,部分RpMΦ可表達CD169分子。同時,結果還發(fā)現(xiàn)F4/80主要分布于圓形區(qū)域以外的紅髓區(qū)域,在邊緣區(qū)有微量的表達,但其熒光強度明顯低于紅髓區(qū)域。2.3 CD169+和CD169-紅髓巨噬細胞差異表達基因分析

為探究CD169+ RpMΦ與CD169-RpMΦ在基因表達水平的差異,本研究通過富集RpMΦ,分選出CD169+和CD169-2個亞群,提取RNA并進行測序分析。在CD169+ RpMΦ群中檢測到9 234個基因,CD169-RpMΦ群中檢測到9 812個基因,其中共同表達的基因有8 866個(圖3A)。主成分分析顯示,2群細胞可以被很好地區(qū)分開(圖3B)。對差異基因進行聚類分析顯示,共有485個差異表達基因,且相比于CD169+ RpMΦ,在CD169-RpMΦ中的上調基因為427個,下調基因為58個(圖3C)。如表達量差異散點圖所示,Siglec1(編碼CD169的基因)在CD169+ RpMΦ群中高表達(圖3D),認為RNA測序結果與分選策略一致;同時,2群細胞共同表達小鼠脾RpMΦ的特征基因,如Vcam1、Axl、Spic、Cd68和Ccr3等,表明這2群細胞均屬于RpMΦ。2.4 CD169-紅髓巨噬細胞的促進炎癥作用
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