目的:建立過表達(dá)細(xì)胞珠蛋白Cytoglobin(CYGB)的人肝細(xì)胞LO-2穩(wěn)定株,初步探究CYGB對LO-2細(xì)胞生長增殖的影響.方法:采用PCR法擴(kuò)增CYGB編碼基因,并通過GATEWAY克隆技術(shù)構(gòu)建慢病毒重組表達(dá)載體Plenti-N-GFP-CYGB;酶切、測序鑒定后,與包裝質(zhì)粒三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)人腎上皮細(xì)胞(HEK293T),收集、濃縮含病毒上清,獲得病毒顆粒;感染LO-2細(xì)胞并采用流式細(xì)胞分選技術(shù)篩選穩(wěn)定細(xì)胞株,Western blot檢測表達(dá)情況;使用CCK-8試劑盒檢測過表達(dá)CYGB對LO-2細(xì)胞增殖的影響,通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測過表達(dá)CYGB對LO-2細(xì)胞凋亡的影響.結(jié)果:慢病毒重組表達(dá)載體Plenti-N-GFP-CYGB雙酶切鑒定以及基因序列比對鑒定均正確.三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞后,熒光顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光;收集病毒顆粒并感染LO-2細(xì)胞后,經(jīng)流式細(xì)胞分選技術(shù)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)CYGB的細(xì)胞,Western blot鑒定顯示,LO-2穩(wěn)定株組的CYGB表達(dá)條帶明顯,陰性對照組未出現(xiàn)條帶.CCK-8法繪制的細(xì)胞生長曲線顯示,穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞組的細(xì)胞生長速率低于陰性對照組,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01).流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組LO-2細(xì)胞凋亡情況結(jié)果顯示,穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞組的細(xì)胞凋亡百分比高于陰性對照組(P0.05).結(jié)論:成功構(gòu)建慢病毒重組表達(dá)載體Plenti-N-GFP-CYGB;建立穩(wěn)定表達(dá)CYGB的人肝細(xì)胞株LO-2-GFP-CYGB以及陰性對照組細(xì)胞株LO-2-GFP;穩(wěn)定表達(dá)CYGB的肝細(xì)胞生長速率較陰性對照組肝細(xì)胞降低,穩(wěn)定表達(dá)CYGB的肝細(xì)胞凋亡百分比高于陰性對照組肝細(xì)胞;為CYGB與其蛋白的相互關(guān)系研究提供了細(xì)胞模型.
【部分圖文】：

用Not Ⅰ和Asc Ⅰ限制酶酶切慢病毒重組質(zhì)粒Plenti-N-GFP-CYGB,酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果中可以看到在500～700 bp之間的位置有明顯條帶(圖2),與預(yù)期條帶大小相符合;重組載體Plenti-N-GFP-CYGB測序結(jié)果,測序片段與預(yù)測的目的基因CYGB序列完全匹配(圖3).圖2 Plenti-N-GFP-CYGB酶切產(chǎn)物

Plenti-N-GFP-CYGB酶切產(chǎn)物

重組載體Plenti-N-GFP-CYGB測序結(jié)果
【相似文獻(xiàn)】

本文編號：2842462