短鏈脂肪酸主要來源于生物體內(nèi)腸道菌群代謝,有著重要的生物學作用。在作為生物體內(nèi)能源物質(zhì)的同時,還具有抗炎、影響腸道菌群代謝和預防早發(fā)I型糖尿病等重要作用。目前多數(shù)研究圍繞傳統(tǒng)脂肪酸而展開,但相關生物學作用還不夠完善,作用機理不夠清楚。此外,對取代短鏈脂肪酸的相關研究尚未見報道。本研究通過采用秀麗隱桿線蟲作為實驗的模式動物,胡桃醌為氧化劑構(gòu)建氧化應激模型,發(fā)現(xiàn)了具有體內(nèi)抗氧化生物活性的取代短鏈脂肪酸,并進一步研究了2′-甲基丁酸對線蟲衰老的影響及其分子機制。(1)短鏈脂肪酸抗氧化生物活性篩選本文以胡桃醌為氧化劑,秀麗隱桿線蟲為模式動物構(gòu)建體內(nèi)抗氧化應激模型,并以此模型檢測傳統(tǒng)短鏈脂肪酸和取代短鏈脂肪酸體內(nèi)抗氧化生物活性。傳統(tǒng)短鏈脂肪酸氧化應激實驗表明,甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸不具有體內(nèi)抗氧化活性,不能延長線蟲氧化應激條件下的存活時間。實驗進一步檢測了取代短鏈脂肪酸對線蟲抗氧化應激能力的影響。甲基取代的短鏈脂肪酸氧化應激實驗結(jié)果表明,2′-甲基丁酸(n=4)、2′-甲基戊酸(n=5)和2′-甲基己酸(n=6)能夠顯著延長線蟲氧化應激條件下的存活時間,具有體內(nèi)抗氧化生物活性,2′-甲基丙酸(n=3)和3′-甲基丁酸(n=4)對線蟲氧化應激條件下存活時間無明顯影響,不具有體內(nèi)抗氧化生物活性,取代短鏈脂肪酸的抗氧化生物活性與取代短鏈脂肪酸的主鏈碳原子數(shù)和取代烷烴的位置有關。為了進一步研究乙基取代短鏈脂肪酸的抗氧化生物活性,通過氧化應激實驗證實2′-乙基丁酸和2′-乙基己酸不具有體內(nèi)抗氧化生物活性,取代短鏈脂肪酸的抗氧化生物活性與取代烷烴的長度有關。綜上表明,傳統(tǒng)短鏈脂肪酸不具有體內(nèi)抗氧化生物學活性,2′-甲基取代短鏈脂肪酸(n=4–6)具有體內(nèi)抗氧化生物活性,其體內(nèi)抗氧化生物活性具有特異性,主鏈碳原子數(shù)、取代烷烴的位置和長度對取代短鏈脂肪酸的抗氧化作用至關重要。(2)2′-甲基丁酸抗氧化作用機理研究以半胱氨酸為陽性對照,通過DPPH和ABTS兩種方法檢測了2′-甲基丁酸體外直接清除自由基的能力。實驗結(jié)果表明2′-甲基丁酸不具有體外直接清除自由基的能力。通過2′,7′二氯氫化熒光素乙二脂染料對線蟲體內(nèi)的活性氧自由基染色,發(fā)現(xiàn)2′-甲基丁酸處理后的線蟲的熒光強度顯著低于對照組,表明2′-甲基丁酸能夠降低線蟲體內(nèi)活性氧自由基的水平。通過高溫和抗生素兩種方式對線蟲喂食的大腸桿菌進行滅活實驗,進一步檢測菌代謝對2′-甲基丁酸體內(nèi)抗氧化生物活性的影響,兩種方式處理的大腸桿菌不影響2′-甲基丁酸的抗氧化生物活性。體外自由基清除實驗及死菌氧化應激實驗的結(jié)果證明,2′-甲基丁酸的抗氧化生物活性不依賴于體外對自由基的清除和菌代謝。通過氧化應激實驗進一步檢測了2ˊ-甲基丁酸對基因突變線蟲抗氧化活性的影響,并確定了其活性所依賴的信號通路。實驗發(fā)現(xiàn),2ˊ-甲基丁酸不能增強生殖腺信號通路突變線蟲glp-1的抗氧化應激能力,能夠增強胰島素信號通路突變體daf-2線蟲、線粒體信號通路突變體clk-1線蟲和飲食限制信號通路突變體線蟲eat-2的抗氧化應激能力,實驗結(jié)果進一步證實2ˊ-甲基丁酸作用于生殖腺信號通路。為了進一步研究2ˊ-甲基丁酸抗氧化作用機理,通過q-PCR和轉(zhuǎn)基因GFP線蟲實驗檢測2ˊ-甲基丁酸對daf-16、sod-3和gst-4等經(jīng)典抗氧化基因表達的影響。實驗結(jié)果表明2ˊ-甲基丁酸能夠上調(diào)gst-4表達,增強相關轉(zhuǎn)基因線蟲GFP熒光強度,進一步證明了2ˊ-甲基丁酸作用于生殖腺信號通路,通過上調(diào)抗氧化基因gst-4的表達增強線蟲抗氧化應激能力。(3)2′-甲基丁酸對線蟲衰老的影響壽命是評價線蟲衰老的最主要的指標。除此之外,線蟲的衰老將伴隨著生殖能力、運動能力和對外界抗性的下降。本文通過線蟲的衰老指標評價2ˊ-甲基丁酸對線蟲衰老的影響。在線蟲生殖能力方面,實驗觀察并統(tǒng)計了線蟲產(chǎn)卵周期和產(chǎn)卵數(shù)目,發(fā)現(xiàn)2′-甲基丁酸能夠延長線蟲的產(chǎn)卵周期,增加線蟲的產(chǎn)卵數(shù)目。在線蟲運動能力方面,實驗統(tǒng)計了線蟲吞咽泵的吞咽頻率和線蟲頭部擺動次數(shù),實驗結(jié)果證明2′-甲基丁酸能夠增加線蟲吞咽泵吞咽頻率和線蟲頭部擺動次數(shù)。在線蟲對外界抗性方面,通過紫外和高溫應激實驗進一步檢測了2′-甲基丁酸對線蟲紫外輻射和高溫應激能力的影響,發(fā)現(xiàn)2′-甲基丁酸能夠增強線蟲對紫外和高溫的應激能力。在線蟲壽命方面,實驗檢測了2′-甲基丁酸對野生型線蟲N2和生殖腺信號通路突變體glp-1的壽命的影響,發(fā)現(xiàn)2′-甲基丁酸能夠顯著延長野生型線蟲N2的壽命,但對突變體線蟲glp-1的壽命無影響,實驗結(jié)果進一步證明2′-甲基丁酸對生殖腺信號通路的作用和影響。
【學位單位】：長春理工大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R383.1
【部分圖文】：

氧化應激模型的構(gòu)建及短鏈脂肪酸實驗濃度的確定：(a)200μM胡桃醌氧化應激模型構(gòu)建流程圖；(b)clk-1(mq130)，daf-2(e1368)突變體線蟲氧化應激條件下生存曲線；(c)不同濃度的2ˊ-

21 - 2 傳統(tǒng)短鏈脂肪酸氧化應激實驗：(a) 甲酸氧化應激實驗，P =0.1269；(b) 乙酸氧化激試.221；(c) 丙酸氧化應激實驗，P = 0.5852；(d) 丁酸氧化應激實驗，P< 0.0001；(e) 戊酸實驗，P< 0.0001；(f) 己酸氧化應激實驗，P = 0.13530 。每次實驗樣本數(shù) 50 條，樣本總150 條。實驗結(jié)果表明，甲酸對線蟲的氧化應激能力無影響，生存曲線同對照組無明 3-2, a)。乙酸同樣不具有抗氧化生物活性，不能延長線蟲氧化應激條件下的(圖 3-2, b)。丙酸處理后的線蟲氧化應激條件下的生存曲線同對照組無顯著差丙酸不能增強線蟲的抗氧化應激能力，不具有體內(nèi)抗氧化生物活性(圖 3-2, c)和戊酸的實驗中，兩種短鏈脂肪酸在一定程度上降低了線蟲氧化應激的能力線蟲氧化應激條件下的存活時間(圖 3-2, d-e)，具體原因還不清楚，有待進一

此外，己酸也不具有體內(nèi)抗氧化生物活性，不能提高線蟲的抗氧化應激能力-2, f)。實驗結(jié)果證明，實驗中采用的 6 種傳統(tǒng)的短鏈脂肪酸皆不能增強秀麗隱的抗氧化應激能力，不能延長線蟲氧化應激條件下的存活時間。取代短鏈脂肪酸氧化應激實驗中，選取了取代位置和取代烷烴長度不同的取脂肪酸，實驗首先檢測了 2 號位甲基取代的短鏈脂肪酸(2ˊ-甲基丙酸、2ˊ-甲基丁ˊ-甲基戊酸、2ˊ-甲基己酸)的體內(nèi)抗氧化生物活性。
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本文編號：2842523