金黃色葡萄球菌是人類的機會性致病菌,可造成淺層皮膚感染和危及生命的侵染疾病。金黃色葡萄球菌的毒性由多種毒性因子決定,這些毒性因子響應于外界環(huán)境變化,受到一系列調(diào)控因子的精確調(diào)控。Protein A是金黃色葡萄球菌中重要的表面蛋白質(zhì),能夠與哺乳動物免疫球蛋白IgG的Fc區(qū)域結(jié)合,幫助細菌進行免疫逃逸。在金黃色葡萄球菌中,spa受到多元調(diào)控因子和復雜的網(wǎng)絡調(diào)控。環(huán)二鳥苷酸c-di-GMP是細菌中普遍存在的第二信使,能夠參與多種病原體中生物被膜的形成,以及毒性調(diào)控等。C-di-GMP一般由含GGDEF結(jié)構域的鳥苷酸環(huán)化酶環(huán)化兩個GTP分子而成,并由含有EAL或HD-GYP結(jié)構域的磷酸二酯酶水解成pGpG或兩個GMP分子。在不同菌株中含GGDEF、EAL和HD-GYP結(jié)構域的蛋白質(zhì)數(shù)量均有差異,但在金黃色葡萄球菌NCTC8325中,只發(fā)現(xiàn)一個編碼保守GGDEF結(jié)構域的基因gdpS,且并未發(fā)現(xiàn)含EAL或HD-GYP結(jié)構域的基因存在。近期的研究發(fā)現(xiàn)在表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌中,GdpS不參與c-di-GMP的合成,而根據(jù)我們研究中的芯片分析結(jié)果,gdpS的失活將引起一系列毒性因子的變化,特別是protein A及它的上游調(diào)控因子SarS,并且與野生型菌株相比,sarS與spa在gdpS敲除株中呈現(xiàn)相同趨勢的轉(zhuǎn)錄水平變化。因此我們推測gdpS可能通過影響sarS的表達以實現(xiàn)對spa的調(diào)控作用。在前期研究中,我們首先發(fā)現(xiàn)gdpS對spa和sarS的影響主要依賴于其N端結(jié)構域,而不是C端結(jié)構域,證明gdpS的調(diào)控功能與c-di-GMP無關。因此在本研究中,我們首先利用定點突變與回補實驗,對gdpS的起始密碼子進行突變或是刪除,并通過熒光定量PCR證明gdpS的蛋白產(chǎn)物不參與sarS的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。之后,我們利用Northern blot檢測gdpS上可能存在的轉(zhuǎn)錄本,排除了gdpS編碼轉(zhuǎn)錄sRNA的可能性,并通過凝膠阻滯實驗分析證明gdpS mRNA可通過直接的RNA-RNA相互作用與sarSmRNA的5'UTR進行堿基配對。同時,我們也根據(jù)序列比對預測出gdpSmRNA與sarSmRNA上可能發(fā)生配對的18個堿基區(qū)域,并利用定點突變與回補實驗對這18個堿基進行不同長度的突變,最后結(jié)合熒光定量PCR與酶活實驗證明這18個堿基區(qū)域,在此調(diào)控過程中發(fā)揮重要功能。此外,我們利用利福平阻斷金黃色葡萄球菌中RNA的轉(zhuǎn)錄,通過熒光定量PCR進行sarSmRNA半衰期的檢測,發(fā)現(xiàn)在gdpS敲除株中,sarS mRNA的半衰期明顯低于野生型與回補株,這一變化顯示gdpS能夠通過增強mRNA穩(wěn)定性的方式,提高胞內(nèi)mRNA的水平,證明gdpS可能最終通過一種調(diào)控RNA的方式影響sarS與spa的表達水平。這一機制的發(fā)現(xiàn)不僅有助于對毒性因子spa調(diào)控網(wǎng)絡的進一步了解,同時闡明gdpS mRNA為金黃色葡萄球菌中最新發(fā)現(xiàn)的雙功能RNA,為其它菌株中調(diào)控RNA的研究提供了思路。此外,在其它菌株中同樣存在某些缺少DGC或PDE酶活性的含GGDEF和EAL結(jié)構域的蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)常具有其它與c-di-GMP無關的生物學活性,對gdpS功能的發(fā)現(xiàn)將有助于對這些基因功能的研究。
【學位單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R378.11
【部分圖文】：

在希臘語中如ｅ意為葡萄串，ＣＯＣＣ／意為球巧細菌，在拉了語中??ｏｗｅｗ化表金色，表明金黃色葡萄球菌為生長呈金黃色葡萄串狀的球狀菌（如??圖１．１）。金黃色葡萄球菌為兼性厭氧微生物，細胞直徑約為１?ｙｍ，革蘭氏染色??陽性。金黃色葡萄球菌細胞壁結(jié)構復雜，由膚聚糖、磯壁酸和多糖等組成，可??幫助細胞抵御高壓環(huán)境，且使抗菌藥物難Ｗ進入細胞，這也是金黃色葡萄球菌??感染難Ｗ治療的原因之一。金黃色葡萄球菌可在廣泛的ＰＨ范圍內(nèi)生存，抗干??旱，耐高鹽，能夠在極端溫度６０?°Ｃ下存活３０?ｍｉｎ，在不適于生存的條件下，??金黃色荀萄球菌也能夠Ｗ休眠狀態(tài)存活數(shù)年。??？圍誦??圖１．１電鏡下的金黃色葡萄球苗（Ｋａｈｌｅｔａｌ．，２０〇３）??注；圖ａ為透射電子顯微鏡下金黃色葡萄球菌細胞分裂狀態(tài)，圖ｂ為低倍（６７００Ｘ）??掃描電子顯微鏡下金黃色葡萄球菌狀態(tài)，圖Ｃ為高倍（３５０００Ｘ）掃描電子顯微??鏡下金黃色葡萄球菌狀態(tài)。??金黃色葡萄球菌通常寄生在恒濕動物的皮膚和黏膜表面

?巧瘡、燙傷樣皮膚綜合征、鼻竇炎、也內(nèi)膜炎、肺炎、骨髓炎、中毒性休克綜??合癥和敗血癥等疾病在內(nèi)的多種感染，嚴重時甚至可造成死ｔ?（如圖１．２）（Ｃｏｉｉｄｅ，??１９９８；Ｐａｎｉｚｚｉｅｔａｌ．，２０１１）。金黃色葡萄球菌可Ｗ產(chǎn)生多種毒性因子，如溶血素、??凝固酶和殺白細胞素等，這些毒性因子決定其致病性的強弱。近年來耐藥菌的??出現(xiàn)，也使得金黃色葡萄球菌的預防和治療更加困難。??妨??帥ｘ？－Ｅ嚴Ｖ八避嚴３??ｒＳｉｍｒ－．．?＞－Ｌｗｈｎｏｄｔｓ??Ａｒｔ該賄ｓ?—苗麥?＼￣￣｜Ｌｕｎ§￥?Ｉ??姆顚??山汾＿’觀＇Ｉ獻觸嗎麵??論幽ｒ．？，Ｖ＞．?禪Ｓ議補??佑?ｄ。巧昨?＾?Ｖ＾ｍ??Ｓｋｅｌｅｔｏｎ?Ｐａｒｓｃｒｅａｓ??虹跑ｉｌ醬」＾?廬?Ｕｒｉｎａｒｙ?Ｗａｄｄａｒ??ｉｉ?＼?＼??圖１．２金黃色葡萄巧茵誘發(fā)的多種感染（Ｍｉｋｅａｌ，２０１４）??注：金黃色葡萄球菌可在人體的《個組織和器官中誘發(fā)感染。其中最為常見的為在皮??膚引起的淺層或深層感染，在屯、臟處引起的屯、內(nèi)膜炎，在肺部引起的肺炎，在骨??髓引發(fā)的骨髓炎，化及由腸毒素等毒性因子在小腸引起的腸炎等。??１丄２金黃色葡萄球菌的進化??金黃色葡萄球菌群的基因組一般表現(xiàn)為環(huán)狀染色體

多位點序列分型（ｍｕ帕ｌｏｃｕｓ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｔｙｐｉｎｇ，?ＭＬＳＴ）為?ＳＴ８，?基因??分型為ｔ２１１，研究過程中可通過與不同臨床流行菌株的比較，進行針對性和特??異性的研究（如圖１．３）?（Ｗｕｅｔａｌ．，２０１０）。隨著測序和芯片等技術的發(fā)展，現(xiàn)已??有多種方法來了解金黃色葡萄球菌的基因組、進化方式和其對壓力環(huán)境如抗生??素等的適應過程。然而，現(xiàn)今關于金黃色葡萄球菌基因組的變化仍存在許多未??知，對菌株進化過程的研究，對人類健康至關重要，可為未來感染的預防和治??療提供方向。??＾?＾?舞獄賴３。燃觀。掛腳??ｇ?ｇ?８１?至ｉ?ｇ?ｉｉｉｉ?８妻《玄秀票旁￥運??Ａ集?！?ＩＨ蒙?含Ｉ?Ｈｉ！八攪?ＣＷ只勒Ｕ０?資；㈱８寒巧?Ｒ巧Ｒ竊ａ持穿Ｓ?Ｓ?Ｓ???ＨＩ?Ｉ?Ｊ｜?Ｉ?零！?巧Ａ＜：０?０４巧ＳＡ１０?４?！Ｖａ?｜?微８?ＳＴＢ?ＣＣ８?Ｒ?Ｓ?Ｒ?Ｓ?Ｓ?Ｓ?Ｓ?Ｓ?Ｓ?８?＾的姑賄??Ｊ?１．?扮微絲巧中Ｗ身！?禱沒巧?ＣＣ８?Ｒ巧Ｒ沒Ｓ?Ｒ?Ｓ?Ｓ?Ｓ?Ｓ?Ｊ??＾?１?Ｉ?Ｉ?Ｉ?｜｜?ｉ?１；１｜。心．了說３錫?Ｗ鴻?－ｍ?＼泛＂容ｒｓ?ＣＣ８?Ｓ?Ｓ?Ｓ?Ｓ?Ｓ?Ｓ化巧嚇Ｓ?Ｓ芽巧折貨令。巧??？?．?；?
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本文編號：2838147