銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種在自然界中廣泛存在的條件性致病菌,能導(dǎo)致多種人體細(xì)菌感染疾病,特別是在一些免疫功能低下的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)的囊性纖維化感染。這類細(xì)菌感染常因?yàn)樯锉荒さ男纬啥y以治愈。在之前的研究中發(fā)現(xiàn),PprA-PprB雙組分系統(tǒng)(TCS)調(diào)控的ⅣVb-Tad菌毛,BapA粘附素和CupE菌毛等物質(zhì)均與一種新型生物被膜的形成有關(guān)。已有的關(guān)于PprB蛋白在細(xì)菌中的生理功能研究主要是以過表達(dá)PprB菌株作為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PprB菌株與野生型菌株相比細(xì)胞膜通透性和氨基糖苷類藥物敏感性上升,而細(xì)菌毒力減弱,并且更有利于強(qiáng)健生物被膜的形成。同時(shí),PprB突變菌株的表型研究中也發(fā)現(xiàn)此菌株形成生物被膜的能力減弱。然而,在野生型菌株中觸發(fā)PprA-PprB雙組分系統(tǒng)響應(yīng)的環(huán)境信號(hào)仍不明確,關(guān)于PprB介導(dǎo)生物被膜形成的分子機(jī)制的研究結(jié)果也比較少。明確觸發(fā)細(xì)菌內(nèi)部的調(diào)節(jié)系統(tǒng)的外部環(huán)境信號(hào),對(duì)于理解細(xì)菌的調(diào)節(jié)系統(tǒng)的信號(hào)通路以及相關(guān)的功能研究至關(guān)重要。在本論文的研究中,我們發(fā)現(xiàn)低碳張力是誘導(dǎo)PprB及其調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)的外部環(huán)境信號(hào),并且確定了 PprB的低碳張力響應(yīng)是因?yàn)槭艿搅隧憫?yīng)一般環(huán)境張力的σ因子RpoS的調(diào)控,而非雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的PprA。同時(shí)我們還觀察到PprB對(duì)其自身轉(zhuǎn)錄的抑制作用,并發(fā)現(xiàn)在銅綠假單胞菌中PprB過表達(dá)極大地增強(qiáng)了細(xì)菌-細(xì)菌間和細(xì)菌-表面間的粘附能力。這種高強(qiáng)度粘附能力的形成與BapA粘附素和CupE菌毛的表達(dá)有很大的關(guān)系,而與Ⅳb-Tad菌毛關(guān)系不大。此外,PprB調(diào)節(jié)的基因在菌落生物膜生長3天時(shí)轉(zhuǎn)錄水平上升,表明此時(shí)的生物被膜可能處于低碳狀態(tài)。本論文確立了一種“低碳張力-RpoS-PprB-BapA/Flp/CupE”的生物被膜形成的新途徑,為今后對(duì)生物被膜形成的理解提供了新的視角。
【學(xué)位單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R378
【部分圖文】：

?第一章緒論???一般來講生物被膜是被胞外ＥＰＳ?（水合聚合物基質(zhì)）包裹的不可逆粘附于表??面的細(xì)菌聚集體。ＥＰＳ的主要組成元素有蛋白質(zhì)，核酸以及多糖＃］。細(xì)菌被ＥＰＳ??包裹并因?yàn)榘饩酆衔锘|(zhì)之間的相互作用而形成能夠抵抗外界環(huán)境張力的生??物被膜。不同環(huán)境，不同菌種形成的生物被膜都會(huì)具有很大形態(tài)差異。??目前對(duì)生物被膜形成的研宄很多［１９－２１］，但仍未確定生物被膜的具體形成機(jī)制。??＊?—

Ｆｌｐ（ｆｉｍｂｒｉａｌｌｏｗ－ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｗｅｉｇｈｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ）蛋白是?Ｔａｄ?菌毛的基本結(jié)構(gòu)單兀，??ＰＡ４２９５編碼的ＦｐｐＡ蛋白是一種天冬氨酸蛋白酶，主要負(fù)責(zé)控制Ｆｌｐ菌毛的成??熟［７ｎ，Ｔａｄ菌毛的組成的可能結(jié)構(gòu)如圖１．３所示。??７??

??２．１．１焚光報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建??本實(shí)驗(yàn)采用的熒光報(bào)告質(zhì)粒，如圖２．１所示：我們使用綠色焚光蛋白Ｓｆｇｆｐ作??為熒光報(bào)告質(zhì)粒的報(bào)告基因，用目標(biāo)啟動(dòng)子作為Ｓｆｇｆｐ熒光蛋白的啟動(dòng)子，所以??細(xì)菌中ＳｆｇＱ）的熒光強(qiáng)度的大小可以用來衡量目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平，使用ＲＢＳｎ??作為結(jié)合能力很強(qiáng)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。為了消除翻譯調(diào)控對(duì)目標(biāo)基因的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)??錄的影響，我們?cè)趩?dòng)子與Ｓｆｇｆｊｓ熒光報(bào)告基因之間加入了?ＲＮＡｓｅｌｌｌ位點(diǎn)，使??焚光報(bào)告基因?＜妨）在轉(zhuǎn)錄為ｍＲＮＡ之后與啟動(dòng)子的其余部分切割開，以免目標(biāo)??啟動(dòng)子序列上的翻譯相關(guān)的調(diào)控區(qū)域影響轉(zhuǎn)錄水平。我們構(gòu)建的熒光報(bào)告質(zhì)粒將??目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，ｒｂｓ區(qū)域和編碼區(qū)前的幾十個(gè)堿基連接在一起至于??ＲＮＡＩＩＩ序列前方位置，啟動(dòng)子區(qū)域一般延伸到ｌＯＯＯｂｐ左右以包含整個(gè)基因的轉(zhuǎn)??錄調(diào)控區(qū)域，但截止在上一個(gè)基因的啟動(dòng)子之前。在熒光報(bào)告質(zhì)粒上還包括以強(qiáng)??啟動(dòng)子Ｊ２３１０２啟動(dòng)的Ｃｙｏｆｐ熒光蛋白基因作為內(nèi)標(biāo)熒光蛋白
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本文編號(hào)：2836111