研究背景和目的目前,世界各國人口趨于老齡化,免疫機能退化是導致機體衰老的一個重要因素。抑制免疫器官的衰老已成為主要的醫(yī)學課題。胸腺是重要的中樞免疫器官,由胸腺細胞和胸腺基質細胞組成,為初始T細胞發(fā)育和成熟提供特殊的微環(huán)境,胸腺微環(huán)境主要由胸腺基質細胞,細胞外基質等組成,其中胸腺上皮細胞(Thymic epithelial cells,TECs)是胸腺微環(huán)境最重要的組成部分,對T細胞的分化、選擇性發(fā)育至關重要。胸腺隨著年齡的增長會出現增齡性萎縮,主要表現為胸腺體積縮小,T細胞輸出下降,TECs減少,脂肪細胞增加等。D-半乳糖(D-galactose,D-gal)可加速小鼠老化,導致神經衰退,免疫功能退化,生殖功能退化等。白藜蘆醇(Resveratrol,RSV)已被證明具有免疫調節(jié)作用,但RSV是否影響胸腺微環(huán)境和預防胸腺退化仍不清楚。轉錄因子叉頭蛋白N1(Forkhead box protein N1,FoxN1)調控TECs的分化和增殖,免疫調節(jié)因子(Autoimmune regulator,Aire)調控髓質胸腺上皮細胞的發(fā)育和成熟,但RSV對FoxN1和Aire功能的影響仍未可知。因此,本研究主要探索RSV對D-gal引起的的胸腺急性退化是否有保護作用,以及RSV是否通過調節(jié)Aire和FoxN1發(fā)揮作用,最終期望為探索胸腺退化機制和RSV改善胸腺功能提供理論基礎和依據。方法1.ICR小鼠(2月齡)50只隨機分為五組,每組10只:對照組、D-gal組、RSV三個劑量組(25、50、100mg/kg.d)。腹腔注射8周D-gal(120mg/kg.d)建立小鼠急速衰老模型,兩周后灌胃不同劑量的RSV。取材3h前腹腔注射溴脫氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine,BrdU)(120mg/kg),取胸腺組織。2.胸腺組織進行石蠟和冰凍切片,以及DNA、RNA的提取。3.流式細胞術:分離胸腺細胞,觀察胸腺細胞亞群(CD4~+,CD8~+)的變化(n=4)。4.衰老相關的β-半乳糖苷酶(Senescence-associatedβ-galactosidas,SA-β-Gal)染色觀察胸腺中細胞衰老的情況(n=3)。5.脫氧核苷酸末端轉移酶介導的dUT缺口末端標記(Terminaldeoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP nick end labeling,Tunel)染色:觀察胸腺中細胞凋亡的情況(n=4)。6.HE染色和免疫組織化學:觀察胸腺形態(tài)變化和BrdU,Aire,FoxN1的表達(n=4)。7.qRT-PCR:檢測Aire,FoxN1的mRNA表達。8.甲基化檢測:亞硫酸氫鹽處理DNA,甲基化特異性PCR檢測Aire,FoxN1基因啟動子區(qū)甲基化的情況;亞硫酸氫鹽修飾后PCR測序檢測Aire基因啟動子區(qū)CpG位點的甲基化情況。結果1.D-gal組與對照組相比:(1)胸腺組織萎縮:胸腺體積縮小,皮髓質分界不清。(2)增殖的細胞減少,衰老和凋亡的細胞增加。(3)Aire,FoxN1蛋白表達下降,mRNA表達降低。(4)Aire,FoxN1基因啟動子區(qū)甲基化水平增加,未甲基化水平降低;Aire基因啟動子區(qū)甲基化的CpG位點增加。2.RSV給予后:(1)胸腺體積增加,皮髓質分界清晰。(2)增殖的細胞增加,衰老和凋亡的細胞減少。(3)Aire,FoxN1蛋白表達升高,mRNA表達增加。(4)Aire,FoxN1基因啟動子區(qū)甲基化水平降低,未甲基化水平升高。結論1.D-半乳糖引起胸腺結構改變,降低Aire,FoxN1的表達。2.白藜蘆醇對D-半乳糖導致的胸腺損傷有保護作用;可能通過促進Aire和FoxN1的表達改善胸腺功能。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

結果1 白藜蘆醇減緩胸腺萎縮.1 白藜蘆醇增加胸腺指數D-gal 處理之后，小鼠胸腺體積明顯小于對照組（圖 1A），小鼠的胸腺指數=胸腺重量 mg/小鼠體重 g）降低（圖 1B），兩組雄性小鼠的差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而灌胃 RSV 之后，與 D-gal 組相積恢復，胸腺指數也有所增加，但差異沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。小鼠雌雄各 4 只，結果可知小鼠的雌雄差異對胸腺指數影響較大（P組雌性小鼠的胸腺指數均大于該組雄鼠的胸腺指數（圖 1C）。

1.2 白藜蘆醇加強胸腺皮髓質區(qū)域化為了闡明 RSV 補充后小鼠胸腺的結構的改變，本實驗通過 HE 染色的方法對各組胸腺樣本進行觀察。結果如圖 2 所示，D-gal 組的胸腺皮層和髓質之間的確定區(qū)域變得模糊，皮髓質分界不清晰，RSV 補充之后小鼠胸腺皮髓質分界清晰，胸腺皮質增厚。說明 D-gal 可以使胸腺區(qū)域化降低，RSV 攝入改善了胸腺萎縮或退化。

22圖 4 小鼠胸腺中 BrdU 標記結果。A：BrdU 標記的免疫組織化學結果。棕色代表 BrdU 陽性細胞，藍色代表蘇木精復染的細胞核。Scale bar:200um, 100um, 20um。B：BrdU 陽性細胞統(tǒng)計結果。D-gal 組小鼠胸腺中 BrdU 陽性細胞明顯降低，RSV 組胸腺中 BrdU 陽性細胞增加。
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