艱難梭菌(Clostridium difficile)是一種革蘭氏陽性、嚴格厭氧的產(chǎn)芽孢桿菌,是抗生素相關(guān)性腹瀉和偽膜性腸炎的主要致病菌。隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用及高毒力流行性菌株的出現(xiàn),艱難梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI)相關(guān)疾病的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢,已成為威脅全球公共健康的重要流行性疾病之一。長期或過量服用抗生素會破壞腸道菌群微生態(tài)的平衡,艱難梭菌乘機快速繁殖,并產(chǎn)生大量的毒素A(TcdA)和毒素B(TcdB)。這兩種毒素是CDI的主要致病因子,具有細胞毒性和腸毒性,能夠?qū)е履c道炎癥反應(yīng),從而引發(fā)CDI相關(guān)疾病。研究表明,艱難梭菌毒素的合成與外部環(huán)境的變化密切相關(guān),如培養(yǎng)基營養(yǎng)成分、培養(yǎng)溫度、氧化還原電位變化等。目前人們對艱難梭菌毒素基因表達調(diào)控的分子機制依然了解甚微。本論文從分析氨基酸對艱難梭菌產(chǎn)毒水平的影響出發(fā),采用高通量測序技術(shù)揭示半胱氨酸對艱難梭菌胞內(nèi)全局代謝過程的影響,研究了半胱氨酸脫硫酶CdsB(cysteine desulfidase B)和碳存儲調(diào)控因子CsrA(carbon storage regulator A)在艱難梭菌中的功能及其對致病相關(guān)代謝過程的調(diào)控作用,為今后對艱難梭菌氨基酸代謝調(diào)控研究提供了大量基礎(chǔ)數(shù)據(jù),對探究艱難梭菌毒素基因表達調(diào)控機制具有重要參考價值,還為CDI相關(guān)疾病有效治療藥物的開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。本論文主要內(nèi)容及結(jié)論如下:本研究分析了TY培養(yǎng)基中不同氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、纈氨酸、色氨酸和精氨酸)的添加對艱難梭菌產(chǎn)毒水平的影響,發(fā)現(xiàn)添加半胱氨酸能夠顯著抑制艱難梭菌R20291菌株毒素基因表達水平。將艱難梭菌R20291菌株分別在TY培養(yǎng)基和添加5 mM半胱氨酸的TY培養(yǎng)基(即TYC培養(yǎng)基)中培養(yǎng),經(jīng)過4小時、8小時和12小時取樣,運用RNA-Seq技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄表達譜分析,分別發(fā)現(xiàn)了216、469和756個差異表達基因(差異倍數(shù)大于2且p-value值小于0.01)。在不同處理時間下,差異表達基因的集群顯著不同,主要集中在氨基酸、硫和鐵的轉(zhuǎn)運、丁酸合成、Wood–Ljungdahl通路、電子傳遞產(chǎn)能以及鞭毛合成等方面。艱難梭菌對半胱氨酸的響應(yīng)是一個復(fù)雜而又系統(tǒng)的過程,涉及細胞內(nèi)的諸多代謝過程,結(jié)合已有報道,推測鐵的轉(zhuǎn)運、氨基酸代謝、能量代謝及鞭毛合成等過程可能對半胱氨酸依賴的產(chǎn)毒調(diào)控具有重要影響。利用ClosTron技術(shù)分別構(gòu)建cdsB、eutW、eutVW、feoB1、feoB2和feoB3基因滅活(突變)菌株,并比較突變菌株與野生型菌株在TY和TYC培養(yǎng)基中的產(chǎn)毒水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),eutVW、eutW、feoB1、feoB2和feoB3基因滅活對艱難梭菌產(chǎn)毒水平無顯著影響,而cdsB基因的滅活解除了TYC培養(yǎng)基中半胱氨酸對艱難梭菌產(chǎn)毒水平的抑制作用。通過生物信息學(xué)和酶譜法對艱難梭菌CdsB的功能進行了鑒定,結(jié)果表明,CdsB是艱難梭菌胞內(nèi)一種主要的誘導(dǎo)型半胱氨酸脫硫酶,添加半胱氨酸時,胞內(nèi)cdsB基因的表達水平顯著上調(diào),硫化氫產(chǎn)量顯著提高。通過5'RACE和啟動子活性測定實驗,發(fā)現(xiàn)cdsB基因啟動子是δ~(54)依賴型啟動子,其轉(zhuǎn)錄起始是在半胱氨酸誘導(dǎo)下,由δ~(54)和增強子蛋白CdsR共同參與完成。利用熒光定量PCR和蛋白免疫印跡比較野生型菌株、cdsB突變菌株和cdsB回補菌株毒素基因表達水平,發(fā)現(xiàn)cdsB突變菌株在TYC培養(yǎng)基中培養(yǎng)時tcdA和tcdB表達水平顯著高于野生型菌株,而cdsB回補菌株毒素基因的表達水平與野生型菌株相當(dāng),說明半胱氨酸對艱難梭菌產(chǎn)毒的抑制作用與胞內(nèi)半胱氨酸的降解有關(guān)。進一步比較了半胱氨酸降解產(chǎn)物硫化鈉、丙酮酸和氯化銨對艱難梭菌產(chǎn)毒水平的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)硫化鈉能顯著抑制艱難梭菌的產(chǎn)毒水平。因此,半胱氨酸對艱難梭菌產(chǎn)毒的抑制作用可能是由于半胱氨酸降解產(chǎn)物的積累,特別是硫化氫的積累引起的。CsrA是一種全局轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子,能調(diào)節(jié)鞭毛合成、毒力因子表達和生物膜形成等多種毒力相關(guān)過程。在艱難梭菌中對CsrA的功能進行了分析鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)csrA基因的過表達能夠?qū)е缕D難梭菌運動性減弱、鞭毛缺陷,對Caco-2細胞的粘附性顯著增強,產(chǎn)毒水平顯著上調(diào),丁醇和乙醇的產(chǎn)量顯著提高。通過序列分析,發(fā)現(xiàn)在鞭毛蛋白基因fliC上游非編碼區(qū)含有CsrA保守結(jié)合位點,由此推測CsrA可能直接與fliC mRNA結(jié)合參與fliC的表達調(diào)控,而其對產(chǎn)毒水平的影響可能是由于fliC表達水平的變化引起的。因此,CsrA在艱難梭菌中參與了鞭毛合成、毒素基因表達、粘附和產(chǎn)溶劑等多個過程的調(diào)控。
【學(xué)位單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R378
【部分圖文】：

第一章 緒論cdE140表示；研究表明，與TcdE140相比，TcdE166和TcdE142的表達能夠有效促進毒，且其表達水平對細胞存活率有重要影響，不同的翻譯產(chǎn)物在TcdE介導(dǎo)的毒素中可能發(fā)揮著特定的作用[120]。然而，TcdE是如何介導(dǎo)毒素釋放，以及這三種構(gòu)體在釋放過程中的作用還有待進一步研究。 外環(huán)境變化對艱難梭菌毒素基因表達的調(diào)控作用研究表明，艱難梭菌的產(chǎn)毒水平會受到外部環(huán)境條件變化的影響，如營養(yǎng)成分度等等，其中營養(yǎng)物質(zhì)信號被認為是影響產(chǎn)毒水平最重要的環(huán)境因素之一。.1 葡萄糖

華南理工大學(xué)博士學(xué)位論文NA-Seq 流程如圖 1-3 所示，主要包括實驗設(shè)計、樣品制備、文庫構(gòu)建、高物信息學(xué)分析五個環(huán)節(jié)[181]。首先結(jié)合研究目的和預(yù)算進行實驗設(shè)計，確測序深度；然后提取樣本總 RNA，進行 mRNA 分離純化；將 mRNA 樣本反轉(zhuǎn)錄，連接測序接頭，富集，完成測序樣本的文庫構(gòu)建；上機測序；測濾后，與參考基因組比對或者從頭組裝，對 reads 進行計數(shù)及表達水平統(tǒng)行差異表達基因分析、代謝通路分析、共表達網(wǎng)絡(luò)分析和 GO 富集分析等

技術(shù)路線示意圖
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 徐亞青;鄧敏;;難辨梭狀芽胞桿菌醫(yī)院感染的流行病學(xué)特征及感染控制現(xiàn)狀分析[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2013年20期

2 黃怡;聶玉強;;難辨梭狀芽孢桿菌相關(guān)性腹瀉與抗生素相關(guān)性腹瀉的臨床流行病學(xué)比較[J];廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2009年04期

本文編號：2835145