[目的]初步探究乙肝核心蛋白(HBc-N144)嵌合奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface protein A,NspA)構(gòu)成的重組蛋白疫苗(HBc-N144-NspA)在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平,特別是黏膜免疫應(yīng)答水平及其免疫保護(hù)效果,為尋找高效黏膜免疫佐劑、研制高效B群流腦疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。[方法]1.構(gòu)建HBc-N144-NspA病毒樣顆粒。通過生物信息學(xué)查找及截取乙肝核心蛋白、奈瑟菌表面蛋白A基因序列,在截短的乙肝核心蛋白(HBc-N144)的免疫顯性區(qū)域(MIR區(qū))79-80位氨基酸之間插入NspA基因,獲得測(cè)序正確的原核質(zhì)粒pET28a-HBc-N144-Ns pA,再將該融合質(zhì)粒表達(dá)重組蛋白HBc-N144-NspA,純化后通過透射電鏡觀察其所形成的病毒樣顆粒。2.評(píng)價(jià)HBc-N144-NspA重組蛋白疫苗的免疫效果。原核表達(dá)的重組蛋白HBc-N144-NspA,純化后免疫雌性BALB/C小鼠,間接ELISA法檢測(cè)血清中特異性IgG、IgG1和IgG2a以及生殖道分泌液中sIgA。分離免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞,檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-4、IFN-γ和IL-17A含量;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞Th1和Th2亞群。血清體外殺菌試驗(yàn)檢測(cè)免疫血清的體外殺菌活性;末次免疫后2周,以致死劑量的腦膜炎奈瑟菌MC58攻擊,觀察疫苗的免疫保護(hù)效果。通過采集小鼠免疫接種部位肌肉組織進(jìn)行病理切片分析炎性浸潤(rùn)情況。[結(jié)果]1.成功構(gòu)建了HBc-N144-NspA病毒樣顆粒。通過透射電鏡觀察HBc-N144、HBc-N144-NspA呈顆粒樣結(jié)構(gòu),它們大小較均一,粒徑分別約為30nm及120nm;2.重組蛋白疫苗組HBc-N144-NspA+F(F為弗氏佐劑)、HBc-N144-NspA和rNspA+F分別免疫小鼠所產(chǎn)生的特異性IgG和sIgA在免疫后42天達(dá)到峰值,其中HBc-N144-NspA組明顯高于rNspA/F組(p0.05),HBc-N144-NspA+F和HB c-N144-NspA組之間相比無顯著性差異(p0.05)。HBc-N144-NspA+F,HBc-N144-NspA,NspA+F組特異性IgG1/IgG2a比值均大于1。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,HBc-N144-NspA+F,HBc-N144-NspA和Nsp A+F誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答均傾向于Th2型。細(xì)胞因子水平的定量檢測(cè)結(jié)果顯示,HBc-N144-NspA+F和HBc-N144-NspA組所產(chǎn)生的IL-4、I NF-γ和IL-17A水平無明顯差異,但均高于NspA+F組。致死量MC58攻擊試驗(yàn)小鼠72h后,HBc-N144-NspA+F,HBc-N144-NspA組均獲得了良好的免疫保護(hù)效果,小鼠存活率均達(dá)90%,明顯高于r NspA+F組75%的存活率。免疫后第六周血清體外殺菌抗體滴度,H Bc-N144-NspA+F組為1:16,HBc-N144-NspA和rNspA+F均為1:8。病理切片結(jié)果顯示,HBc-N144-NspA+F組與NspA+F組均出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),而HBc-N144-NspA組未產(chǎn)生明顯的炎性浸潤(rùn)。[結(jié)論]1、構(gòu)建的HBc-N144-NspA病毒樣顆粒具有良好的免疫原性,可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性體液免疫,尤其是黏膜免疫。2、HBc-N144-NspA重組蛋白疫苗組血清體外殺菌活性較高,對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠有較強(qiáng)的保護(hù)作用,且免疫保護(hù)效果明顯高于NspA+F組。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

第 4 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果第 4 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1 HBc-N144-NspA 構(gòu)建以及 rNspA, HBc-N144, HBc-N144-NspA 的表達(dá)、純化及 Western blot 鑒定4.1.1 嵌合蛋白 HBc-N144-NspA 結(jié)構(gòu)圖通過查詢 GeneBank 找到 HBV 堿基序列以及 NspA 堿基序列，通過比對(duì)篩選出乙肝核心蛋白氨基端前 144 位氨基酸，該 144 位氨基酸是主要的衣殼蛋白裝配區(qū)域，本研究通過將 NspA 插入到衣殼蛋白裝配區(qū)域中的免疫顯性區(qū)，位于 78-79 位氨基酸之間，并且為了進(jìn)行 Ni+層析柱純化，在構(gòu)建過程中將 His標(biāo)簽添加到該嵌合蛋白 C 端（圖 4.1.1）。

22圖 4.1.2 NspA 以及 HBc-N144-NspA 三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig 4.1.2 The NspA and HBc-N144-NspA proteins were predicted and modeledby PHYRE 2.Notes: Six views (Front, Back, Left, Right, Upper and Under) of the predictedstructures were presented by chimera 1.12.4.1.3 rNspA, HBc-N144, HBc-N144-NspA 的表達(dá)、純化原核質(zhì)粒rNspA, HBc-N144, HBc-N144-NspA分別加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6h, 表達(dá)的蛋白采用 Ni-NTA 親和層析技術(shù)純化，收集目的蛋白經(jīng) SDS-PAGE 分析，得到相對(duì)分子質(zhì)量 HBc-N144(16kDa)、HBc-N144-NspA(37 kDa)以及 rNspA(26kDa)相符的目的條帶（圖 4.1.3）。

圖 4.1.3 HBc-N144, rNspA, HBc-N144-NspA 的 SDS-PAGE 分析（15%凝膠）Fig 4.1.3 Analysis of the recombinant proteins HBc-N144, rNspA,HBc-N144-NspA by SDS-PAGE. Lane M: protein molecular weight marker in kDa;(A) Lane 1: uninduced bacteria expressing HBc-N144; Lane 2: induced bacteriaexpressing HBc-N144; Lane 3: purified HBc-N144; (B)Lane1: induced bacteriasupernatant expressing HBc-N144-NspA; Lane 2: induced bacteria sedimentexpressing HBc-N144-NspA; Lane 3-5: purified HBc-N144-NspA with serialconcentration of elution buffer. (C) Lane 1-5: purified rNspA4.1.4 rNspA, HBc-N144, HBc-N144-NspA 的 Western blot 鑒定純化的 rNspA, HBc-N144, HBc-N144-NspA 經(jīng) Western blot 分析（一抗：鼠抗 rNspA 血清, 抗 HBc-N144 血清, 抗 HBc-N144-NspA 血清；二抗：山羊抗鼠IgG），在約 16 kDa、26 kDa 以及 37kDa 處觀察到清晰的特異性條帶（圖 4.1.4）。

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1 徐Z

本文編號(hào)：2833971