第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)、純化及鑒定 目的建立一種體外培養(yǎng)、純化SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的簡便有效方法,為后續(xù)的實驗提供細(xì)胞來源。 方法 1.取2周純系清潔級雄性SD大鼠,全骨髓貼壁法培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,通過體外培養(yǎng)及連續(xù)傳代方法純化、擴增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 2.倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化,利用流式細(xì)胞儀(FCM)鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面膜抗原。 3.對分離培養(yǎng)的細(xì)胞行成骨、成軟骨、成脂肪誘導(dǎo)分化,進(jìn)一步確定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化潛能。 結(jié)果 1.取材6h后可見細(xì)胞貼壁,散在分布,3d后貼壁細(xì)胞牢固粘附,細(xì)胞體積增大,顆粒增多,呈現(xiàn)集落生長,7d后細(xì)胞胞體狹長,漩渦狀或紡錘狀排列,傳代后,細(xì)胞形態(tài)均一； 2.流式細(xì)胞術(shù)鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜表面抗原CD90、CD105、CD73、D34、CD45、CD14陽性率分別為99.4%、99.7%、99.6%、2.0%、2.5%、3.5%； 3.成骨誘導(dǎo)分化后行茜素紅染色呈現(xiàn)大量橘紅色的鈣結(jié)節(jié),成脂肪誘導(dǎo)分化后行油紅O染色可見胞漿內(nèi)大量鮮紅的脂滴,折光性極強,成軟骨誘導(dǎo)分化后形成質(zhì)地致密的細(xì)胞團(tuán),阿利新藍(lán)染色可見細(xì)胞內(nèi)大量藍(lán)色基質(zhì)顆粒。 結(jié)論全骨髓貼壁法并連續(xù)傳代法能得到純化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,是一種簡便而又有效的分選培養(yǎng)方法。用此方法培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長狀態(tài)良好、性狀穩(wěn)定、分化潛能強大,是一種理想的組織工程種子細(xì)胞,并為后續(xù)的實驗提供了穩(wěn)定的細(xì)胞來源。 第二部分Wnt通路和Sox9互反饋調(diào)節(jié)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化中的作用 目的通過觀察Wnt通路與Sox9在MSCs成軟骨誘導(dǎo)分化過程的表達(dá)及關(guān)聯(lián),并重點研究Wnt通路調(diào)控Sox9表達(dá)調(diào)節(jié)MSCs成軟骨分化的作用及機制,以及Sox9過表達(dá)反饋調(diào)節(jié)Wnt通路的活性影響MSCs成軟骨分化的作用。從而為更精細(xì)控制MSCs分化,促進(jìn)創(chuàng)傷愈合,豐富再生醫(yī)學(xué)提供理論依據(jù)。 方法 1.體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,LiCl刺激干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,CCK-8法觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性以及Western blot檢測PCNA的表達(dá)情況。 2.在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化中,Western blot、RT-qPC檢測各時期軟骨指標(biāo)Sox9、Collagen2a、Aggrecan及Wnt通路關(guān)鍵分子β-catenin的表達(dá)情況,并LiCl及Dkk-1分別刺激干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化,重點檢測早期(第7d)及晚期(第21d)Wnt通路的蛋白表達(dá)及軟骨相關(guān)指標(biāo)的mRNA及蛋白的表達(dá)情況。 3.在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化后期(21d-35d), RT-qPCR檢測成熟軟骨Collagen2a及肥大指標(biāo)Collagen10、早期成骨分化指標(biāo)RUNX2mRNA水平,Western blot檢測β-catenin及Sox9蛋白的表達(dá)。通過LiCl及Dkk-1刺激干預(yù),在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化后期(28d),Western檢測Collagen2a、Collagen10、RUNX2蛋白等分化指標(biāo)以及Sox9及β-catenin蛋白水平。 4.Sox9慢病毒載體陽性轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,RT-qPCR檢測成軟骨誘導(dǎo)分化過程中Collagen2a、Aggrecan表達(dá)水平,定量測定分泌型GAG含量,同時Western blot檢測Sox9及β-catenin蛋白水平；在成軟骨誘導(dǎo)分化第21天,免疫熒光檢測Collagen2a表達(dá)情況,Western blot檢測Wnt通路相關(guān)蛋白GSK-3β、β-catenin、 p-β-catenin蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 1.LiCl刺激組的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力增強,且高表達(dá)PCNA蛋白。 2.在成軟骨誘導(dǎo)分化中,Sox9、Collagen2a、Aggrecan的mRNA及蛋白表達(dá)隨著時間延長逐漸增高,分泌型GAG含量隨著時間逐漸增高,且在第14d增加顯著,而P-catenin蛋白出現(xiàn)先減少后增加的表達(dá)趨勢。在成軟骨誘導(dǎo)分化早期(第7d), LiCl促進(jìn)β-catenin蛋白表達(dá),同時促進(jìn)增殖相關(guān)蛋白PCNA及Cyclin D蛋白的表達(dá),而Dkk-1抑制β-catenin蛋白表達(dá)并減少PCNA及Cyclin D蛋白的表達(dá)；在LiCl組Sox9、Collagen2a、Aggrecan蛋白軟骨相關(guān)指標(biāo)表達(dá),Dkk-1組有相反的結(jié)果。在成軟骨誘導(dǎo)分化晚期(第21d),LiCl組P-catenin蛋白表達(dá)增高而Dkk-1組表達(dá)受抑制,同時LiCl組阿利新藍(lán)染色明顯增強而Dkk-1組染色減弱；分泌型的GAG含量測定有相似的結(jié)果；軟骨指標(biāo)Sox9、Collagen2a、 Aggrecan mRNA及蛋白測定顯示LiCl組表達(dá)明顯增高,而Dkk-1組明顯減低。 3.在成軟骨誘導(dǎo)分化后期(21d-35d),隨著時間的延長,Collagen2a表達(dá)逐漸減少,Collagen10及RUNX2mRNA表達(dá)逐漸增高,而β-catenin蛋白表達(dá)逐漸增多,與Sox9蛋白表達(dá)恰恰相反。在LiCl及Dkk-1干預(yù)下,我們發(fā)現(xiàn)LiCl在促進(jìn)β-catenin蛋白表達(dá)增多的同時,明顯促使Sox9及Collagen2a蛋白表達(dá)下調(diào),并上調(diào)Collagen10a及RUNX2蛋白的表達(dá)。 4.在對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染Sox9慢病毒后,我們設(shè)置了Sox9慢病毒轉(zhuǎn)染組。在成軟骨誘導(dǎo)分化中,轉(zhuǎn)染組明顯高表達(dá)Collagen2a及Aggrecan mRNA,分泌型GAG含量測定也顯示轉(zhuǎn)染組顯著高于對照組,同時在Western blot檢測中,轉(zhuǎn)染組β-catenin蛋白表達(dá)顯著低于對照組。在成軟骨誘導(dǎo)分化第21天,免疫熒光顯示轉(zhuǎn)染組明顯高表達(dá)Collagen2a,此時的Western blot檢測顯示GSK-3p蛋白及β-catenin磷酸化水平增高。 結(jié)論 1.LiCl能激活Wnt通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞快速增殖。 2.LiCl激活Wnt通路關(guān)鍵蛋白β-catenin,在成軟骨誘導(dǎo)分化中,早期主要促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞快速增殖,同時調(diào)控Sox9促進(jìn)成軟骨誘導(dǎo)分化；晚期則繼續(xù)調(diào)控Sox9促進(jìn)成軟骨誘導(dǎo)分化為主；后期逐漸下調(diào)Sox9,減弱成熟軟骨表型表達(dá),促進(jìn)軟骨肥大及早期成骨。而Dkk-1抑制Wnt通路,起到相反的作用。 3.Sox9過表達(dá)反饋抑制β-catenin的表達(dá),并促進(jìn)β-catenin蛋白降解,最終維持成軟骨誘導(dǎo)分化。 第三部分Wnt通路與NF-κB通路共調(diào)節(jié)在炎性環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的作用 目的探討Wnt通路調(diào)控對炎癥環(huán)境骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的影響,分析Wnt通路和NF--κB通路的相互作用關(guān)系,為促進(jìn)干細(xì)胞炎癥環(huán)境成軟骨分化和臨床治療關(guān)節(jié)軟骨損傷提供一種可行方案。 方法 1.體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,IL-1刺激創(chuàng)造炎性微環(huán)境,并行成軟骨誘導(dǎo)分化,阿利新藍(lán)染色檢測軟骨基質(zhì)內(nèi)硫酸軟骨素的表達(dá),定量檢測分泌型GAG含量。 2.在IL-1刺激的炎性微環(huán)境下行成軟骨誘導(dǎo)分化,同時分別予以Wnt激動劑LiCl及抑制劑GSK-3β刺激干預(yù),第21d時免疫熒光檢測Collagen2a表達(dá)情況,分泌型GAG含量定量檢測,RT-qPCR檢測成軟骨指標(biāo)Sox9、Collagen2a、 Aggrecan mRNA的表達(dá)；與此同時,Western blot檢測NF--κB通路相關(guān)蛋白Ikkβ蛋白、IKB蛋白、NF-κB蛋白及其相應(yīng)磷酸化水平,以及NF-κB蛋白核內(nèi)表達(dá)情況；Western blot檢測Wnt通路相關(guān)蛋白P-catenin蛋白、GSK-3p蛋白及其相應(yīng)磷酸化水平,以及β-catenin蛋白核內(nèi)表達(dá)情況 結(jié)果IL-1組阿利新藍(lán)染色明顯減弱,分泌型GAG含量顯著降低,且軟骨指標(biāo)Sox9、Collagen2a、Aggrecan mRNA較空白對照組顯著減低。在IL-1刺激的炎性微環(huán)境下成軟骨誘導(dǎo)分化中,免疫熒光顯示LiCl組Collagen2a表達(dá)明顯增多,分泌型GAG含量也明顯增多,同時RT-qPCR顯示LiCl組軟骨指標(biāo)Sox9、Collagen2a、Aggrecan mRNA也明顯表達(dá)增多,而GSK-3p組則表現(xiàn)相反的結(jié)果。與此同時,Western blot發(fā)現(xiàn)LiCl組的NF--κB通路相關(guān)蛋白IKB蛋白、NF-κB蛋白顯著增多,相應(yīng)蛋白磷酸化水平明顯減低,但GSK-3β組相應(yīng)蛋白磷酸化水平顯著增高,核蛋白分析發(fā)現(xiàn)LiCl組的NF-κB核內(nèi)表達(dá)明顯減弱而GSK-3β組顯著增多；另外,Western blot檢測Wnt通路相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)LiCl能顯著抑制GSK-3β磷酸化,從而抑制β-catenin蛋白磷酸化,增加其表達(dá),并促進(jìn)去核內(nèi)聚集,而GSK-3β組恰有相反結(jié)果。 結(jié)論IL-1刺激的炎性微環(huán)境不利骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化。Wnt通路激動劑LiCl能顯著抑制GSK磷酸化,從而抑制β-catenin蛋白磷酸化,增加其表達(dá),并促進(jìn)去核內(nèi)聚集,同時競爭抑制NF-κB核內(nèi)受體,反饋調(diào)節(jié)NF-κB通路,從而促進(jìn)炎性環(huán)境下骨髓間充質(zhì)成軟骨誘導(dǎo)分化的進(jìn)行。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R329.2
【文章目錄】：
華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文創(chuàng)新點概述
中文摘要
Abstract
前言
    參考文獻(xiàn)
第一部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)、純化及鑒定
    前言
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
    參考文獻(xiàn)
第二部分 Wnt通路和Sox 9互反饋調(diào)節(jié)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化中的作用
    前言
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
    參考文獻(xiàn)
第三部分 Wnt通路與NF-κB通路共調(diào)節(jié)在炎性環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的作用
    前言
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
    參考文獻(xiàn)
總結(jié)
綜述
    參考文獻(xiàn)
英文縮略詞表(附錄1)
博士期間發(fā)表及待發(fā)表的文章（附錄2)
    期刊文章（第一作者）
    會議論文（主要）
致謝

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本文編號：2831965