第一部分先天性巨結(jié)腸模型小鼠(Ednrb敲除小鼠)腸道P物質(zhì)及NK細(xì)胞的變化在先天性巨結(jié)腸相關(guān)性小腸結(jié)腸炎發(fā)病中的作用目的:使用Ednrb敲除小鼠作為先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung disease,HD)模型小鼠,研究在未發(fā)生及發(fā)生先天性巨結(jié)腸相關(guān)性小腸結(jié)腸炎(Hirschsprung disease associated enterocolitis,HAEC)時(shí)腸管擴(kuò)張段及狹窄段P物質(zhì)(Substance P,SP)及NK細(xì)胞的變化,并探究SP及NK細(xì)胞相互作用在HAEC發(fā)病中的機(jī)制。方法:從美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買(mǎi)Ednrb敲除小鼠,分為HD組和野生型對(duì)照組,并按小鼠年齡分為1周(week,w)、2w及3w組,3w組HD小鼠發(fā)生HAEC。HE染色對(duì)腸管炎癥程度進(jìn)行評(píng)估,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析各組腸管的基因表達(dá)差異,免疫組化和熒光染色分析擴(kuò)張段及狹窄段腸管SP及NK細(xì)胞表達(dá)情況,RT-q PCR和Western blot分別在m RNA和蛋白水平分析SP和NK細(xì)胞相互作用過(guò)程相關(guān)的SP、Nkp46、RORgammat、NK1R、IFNgamma、穿孔素、顆粒酶B及IL22的表達(dá),代謝組學(xué)研究結(jié)腸內(nèi)糞便的代謝化合物變化并關(guān)聯(lián)分析與腸組織基因表達(dá)之間的關(guān)系。結(jié)果:3w組HD小鼠發(fā)生HAEC,且擴(kuò)張段炎癥表現(xiàn)嚴(yán)重,狹窄段輕微;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)3w HD小鼠擴(kuò)張段的基因表達(dá)變化最為明顯,主要為免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)相關(guān)基因,狹窄段基因表達(dá)變化并不如此明顯,但SP在3w HD小鼠的狹窄段中明顯上升。免疫組化和熒光染色顯示3w小鼠狹窄段SP表達(dá)升高,NK細(xì)胞及其亞群NK-22細(xì)胞增加,SP、Nkp46、RORgammat、NK1R、IFNgamma及IL22的表達(dá)在3w HD小鼠狹窄段上升。代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)淀粉及蔗糖代謝途徑和戊糖及葡糖糖醛酸轉(zhuǎn)化途徑在發(fā)生HAEC小鼠中出現(xiàn)明顯改變并與多種神經(jīng)相關(guān)基因明顯相關(guān)。結(jié)論:HD小鼠發(fā)生HAEC時(shí),擴(kuò)張段炎癥嚴(yán)重而狹窄段較輕,而狹窄段是腸神經(jīng)系統(tǒng)異常的部位,狹窄段的SP、NK細(xì)胞、SP在免疫細(xì)胞上的受體NK1R、及NK細(xì)胞分泌相關(guān)因子表達(dá)增加,說(shuō)明SP與NK細(xì)胞之間的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)可能在HAEC發(fā)生時(shí)起到維持腸道穩(wěn)態(tài)的作用。第二部分HD患兒腸道SP及NK細(xì)胞的變化在HAEC發(fā)病中的作用目的:收集HD患兒腸道標(biāo)本,對(duì)人類(lèi)HD腸管擴(kuò)張段和狹窄段SP的表達(dá)及NK細(xì)胞的分布情況進(jìn)行研究,探究SP與NK細(xì)胞在HAEC發(fā)病中的作用。方法:收集HD患兒的腸道標(biāo)本,按照有無(wú)HAEC進(jìn)行分組,并取無(wú)腸神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常的先天性肛管直腸畸形患兒的腸管作對(duì)照組,行HE染色評(píng)估腸道炎癥,通過(guò)免疫組化及熒光的方法觀察SP及NK細(xì)胞在各段腸管的表達(dá)情況,利用RT-q PCR及Western blot從m RNA及蛋白水平分析SP及NK細(xì)胞相互作用過(guò)程中的SP、CD16、NK1R、IFNgamma、穿孔素、顆粒酶B及IL22表達(dá)情況。結(jié)果:在發(fā)生HAEC的患兒腸道狹窄段炎癥表現(xiàn)弱于擴(kuò)張段,免疫組化及熒光染色發(fā)現(xiàn)其狹窄段表達(dá)較多的SP及分布更多的NK細(xì)胞,在未發(fā)生HAEC的HD患兒組的結(jié)果中,SP、CD16、NK1R、IFNgamma、顆粒酶B、穿孔素及IL22在對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)張段及狹窄段中的m RNA及蛋白表達(dá)水平相似,均未見(jiàn)明顯差異。在發(fā)生HAEC患兒組的結(jié)果中,SP、CD16、NK1R、IFNgamma及IL22的m RNA及蛋白表達(dá)水平在HAEC組狹窄段的表達(dá)水平高于擴(kuò)張段及對(duì)照組;顆粒酶B的m RNA及蛋白表達(dá)水平在擴(kuò)張段的表達(dá)高于狹窄段,但與對(duì)照組未見(jiàn)明顯差異;穿孔素的m RNA及蛋白表達(dá)水平在擴(kuò)張段的表達(dá)水平高于狹窄段和對(duì)照組。結(jié)論:HD患兒發(fā)生腸炎時(shí),擴(kuò)張段炎癥重于狹窄段,狹窄段的SP、NK細(xì)胞及相關(guān)因子表達(dá)增加,說(shuō)明SP與NK細(xì)胞之間的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)可能在患兒發(fā)生HAEC發(fā)生時(shí)起到維持腸道穩(wěn)態(tài)的作用。第三部分體外實(shí)驗(yàn)研究SP與NK細(xì)胞的相互作用及機(jī)制目的:分選小鼠結(jié)腸的NK細(xì)胞和培養(yǎng)人NK細(xì)胞系NK92MI細(xì)胞,分別加SP刺激培養(yǎng)后,觀察NK細(xì)胞的功能變化并對(duì)其中機(jī)制進(jìn)行探討。方法:磁珠分選純化小鼠結(jié)腸NK細(xì)胞。分為對(duì)照組、梯度濃度SP刺激組及NK1R拮抗劑Aprepitant+梯度濃度SP刺激組,LDH釋放法檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷活性;ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IFNgamma的濃度,免疫熒光觀察NK細(xì)胞IFNgamma及IL22表達(dá)。NK92MI細(xì)胞系按同樣條件分組,并檢測(cè)NK92MI細(xì)胞殺傷活性及培養(yǎng)上清中IFNgamma的濃度,將SP刺激后的NK細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析其中可能作用機(jī)制,利用Caco2細(xì)胞構(gòu)建腸上皮屏障模型,免疫熒光及Western blot觀察SP刺激后的NK細(xì)胞對(duì)緊密連接蛋白ZO-1的影響。結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)所采用方法提取NK細(xì)胞的純度為93.50%。SP可增強(qiáng)小鼠Nkp46(+)NK細(xì)胞的殺傷活性并促進(jìn)其分泌IFNgamma和IL-22的作用,且與濃度相關(guān),最佳濃度為10-8M,Aprepitant可阻斷此作用;SP可增強(qiáng)NK92MI細(xì)胞系的殺傷活性及促進(jìn)其分泌IFNgamma,最佳濃度為10-10M,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序顯示MAPK信號(hào)其中作用。加入SP處理的NK92MI細(xì)胞組中Caco2細(xì)胞的ZO-1表達(dá)水平下降最明顯。結(jié)論:SP可增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性并促進(jìn)其分泌作用,通過(guò)受體NK1R起作用,相關(guān)通路可能為MAPK信號(hào)通路,僅具有殺傷功能的NK92MI細(xì)胞系對(duì)腸上皮具有破壞作用,而提取的Nkp46(+)小鼠原代NK細(xì)胞,由于包括NK-22細(xì)胞群,其分泌的IL22對(duì)腸上皮具有修復(fù)和保護(hù)作用,二者的相互平衡使腸道對(duì)病原具有更強(qiáng)殺傷抑制作用同時(shí)可保護(hù)腸上皮完整性維護(hù)腸道穩(wěn)態(tài)。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R726.5;R-332
【部分圖文】：

巨結(jié)腸模型小鼠基因型鑒定 出現(xiàn) 244bp 和 44僅在 444bp 出現(xiàn)一條條帶的基因型為 Ednrb+/+下圖左側(cè)所示，與 Ednrb+/-表型相同，Ednrb-/

圖 1-2 1w、2w 及 3w 小鼠結(jié)腸標(biāo)本 HE 染色情況 1w 和 2w 先天性巨結(jié)腸小鼠與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸近端和遠(yuǎn)端無(wú)明顯炎癥表現(xiàn)，粘膜結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，3w 先天性巨結(jié)腸小鼠在擴(kuò)張段（近端）結(jié)腸的粘膜層，出現(xiàn)了隱窩膿腫，且在粘膜層和粘膜下層可見(jiàn)較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，狹窄段（遠(yuǎn)端）結(jié)腸未見(jiàn)明顯炎癥表現(xiàn)。（HD，先天性巨結(jié)腸）

標(biāo)本的基因表達(dá)水平顯示了樣本基因表達(dá)的分布情況及樣品中基因豐度隨表達(dá)量變化的趨勢(shì)，對(duì)所測(cè)樣本的基因表達(dá)量進(jìn)行了整體描述

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本文編號(hào)：2829704