集落刺激因子(colony-stimulating factors,CSFs)是分泌糖蛋白,以結(jié)合造血干細(xì)胞表面上的受體,從而激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑并使細(xì)胞增殖、分化成特定種類的細(xì)胞因子。CSFs包括巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF,macrophage-CSF),粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF,granulocyte-macrophage-CSF)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF,granulocyte-CSF)。GM-CSF通常用于將單核細(xì)胞分化為Ⅰ型巨噬細(xì)胞(type 1 macrophage,M1),M-CSF用于將單核細(xì)胞分化為Ⅱ型巨噬細(xì)胞(type 2 macrophage,M2)。G-CSF通常用于臨床促進(jìn)骨髓干細(xì)胞向外周血的動員以輔助治療中性粒細(xì)胞減少癥。然而,它在單核細(xì)胞分化中的作用很少被研究。因此,本研究的主要目的是明確G-CSF能否分化單核細(xì)胞成為MΦ的表型以及由GCSF分化單核細(xì)胞的MΦ表型,在有或沒有佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)預(yù)處理,然后通過LPS向M1或M2亞型極化。雖然用不同的分化處理對原代單核細(xì)胞和單核細(xì)胞系分化形成MΦ極化趨向M1和M2,但不一定具有典型的M1或M2免疫生物學(xué)表型,具有可塑性。1、G-CSF穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞的建立。構(gòu)建慢病毒表達(dá)系統(tǒng),通過轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化成功建立穩(wěn)定表達(dá)M-CSF、GM-CSF、G-CSF的293T細(xì)胞系,應(yīng)用蛋白免疫印跡、免疫熒光以及ELISA測定了細(xì)胞的MCSF、GM-CSF、G-CSF穩(wěn)定表達(dá)水平,證實獲得M-CSF、GM-CSF、G-CSF穩(wěn)定表達(dá)的293T細(xì)胞系。2、流式鑒定M/GM/G-CSF分化THP-1與巨噬樣細(xì)胞。通過細(xì)胞流式分析M1標(biāo)志物CD80、CD86、MHCⅡ和M2標(biāo)志物CD16,檢測不同CSF誘導(dǎo)分化單核細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,G-CSF將THP-1細(xì)胞分化為M2,如M-CSF,而不像GM-CSF將THP-1細(xì)胞分化成M1。PMA將THP-1分化為M1,然后G-CSF、GM-CSF和M-CSF的分化對PMA刺激的MΦ亞型沒有顯著影響。通過PMA刺激THP-1得到MΦ樣細(xì)胞被3個CSFs分化,再通過LPS極化后,巨噬樣細(xì)胞更加向M1極化,使CD80或CD86表達(dá)更多,CD163表達(dá)更少。3、實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)分析不同CSF分化THP-1獲得巨噬樣細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)。利用qRT-PCR對IL-6,IL-8,IL-12,IL-23(炎性免疫應(yīng)答產(chǎn)物)和IL-10 mRNA(抑炎性免疫應(yīng)答產(chǎn)物)表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,用LPS刺激后,使用PMA、G-CSF、GM-CSF和M-CSF從THP-1分化的MΦ-like均具有良好的炎性標(biāo)志物表達(dá)水平,抑炎免疫應(yīng)答產(chǎn)物IL-10沒有顯著表達(dá)。4、巨噬樣細(xì)胞對結(jié)核桿菌(Mycobacterium Tuberculosis,Mtb)H37Ra吞噬及殺傷的影響用Mtb H37Ra感染MΦ,以研究感染后第一時間的免疫應(yīng)答特性。研究表明,PMA組中經(jīng)三種集落刺激因子誘導(dǎo)的巨噬樣細(xì)胞都被Mtb H37Ra進(jìn)一步活化,炎性因子IL-8均顯著表達(dá)。在對CSFs分化的巨噬樣細(xì)胞感染Mtb H37Ra的吞噬及殺菌能力分析后,顯示被G-CSF分化的巨噬樣細(xì)胞吞噬能力僅次于GM-CSF分化的巨噬樣細(xì)胞,卻又強于M-CSF。G-CSF分化的巨噬樣細(xì)胞在72h的殺菌能力與MCSF無差異,但殺菌能力卻顯著弱于GM-CSF分化的巨噬樣細(xì)胞。總之,由PMA驅(qū)動的G-CSF分化的MΦ樣細(xì)胞在其表面標(biāo)記和細(xì)胞因子表達(dá)方面與GM-CSF分化的MΦ樣細(xì)胞相似。在細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)方面,來自THP-1的G-CSF分化的MΦ是M2,類似于M-CSF分化的巨噬細(xì)胞,但是在細(xì)胞因子表達(dá)方面G-CSF分化THP-1具有低水平的IL-10表達(dá)。在PMA驅(qū)動下G-CSF分化的巨噬樣細(xì)胞的噬菌能力增加,但殺菌能力并不像GM-CSF。
【學(xué)位單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述系統(tǒng)的影響。觀察到服用 G-CSF 的健康志愿者的血液顯示出促炎細(xì)胞因子（如TNF- （腫瘤壞死因子）、GM-CSF）在體外用脂多糖（LPS）刺激時的釋放能力減弱，表明 G-CSF對炎癥免疫反應(yīng)有抑制作用[39]。為闡明 M1和 M2 各自的功能，現(xiàn)將人源的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞定向分化成 M1或 M2 巨噬細(xì)胞的方案已日趨成熟，最常規(guī)的方案便是利用 GM-CSF/LPS±IFN-γ 組合誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成促炎的 M1 巨噬細(xì)胞；利用 M-CSF±IL-4 組合將單核細(xì)胞分化成抑炎型的 M2巨噬細(xì)胞[40,41]，如圖 1。

13圖 2 M/GM/G-CSF穩(wěn)定表達(dá)的實驗驗證。Figure 2. Experimental validation of stable expression of M/GM/G-CSF.A. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 M-CSF、GM-CSF 和 G-CSF 的細(xì)胞標(biāo)簽熒光圖。 B. Weston blot 對 M-CSF、GMCSF 和 G-CSF 表達(dá)量的鑒定。 C. ELISA 在蛋白水平測定 M-CSF、GM-CSF 和 G-CSF 的表達(dá)量

棄液后加入配置好且預(yù)冷含胰蛋白酶的 FACS washing buffer 400 μl，在冰盒上搖至貼壁細(xì)胞脫落（對于難以脫落的細(xì)胞孔使用移液槍吹吸），懸浮于 400 μl 冷 FACS溶液中，將貼壁細(xì)胞處理并收集于實驗組流式管內(nèi)，并與 PE-Cy7-Hu CD80、PE-HuCD86、FITC-Hu MHCⅡ或 APC-Hu CD163 的抗體反應(yīng)，4℃孵育 30 min，PBS 洗 3次，用 100 μl PBS 重懸，上流式細(xì)胞儀檢測。設(shè)置同型對照組，每管均加入同型抗體：CD80-Ms IgG1、CD86-Ms IgG2b Kpa、CD163-Ms IgG1 Kpa ITCI、MHCⅡ-MsIgG2a Kpa ITCI。通過在正向和側(cè)向散射上設(shè)置門，顯示活細(xì)胞的光散射特性的細(xì)胞，從分析中排除細(xì)胞碎片。對每個樣品分析最少 104個細(xì)胞。3.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析使用 FlowJo v10 軟件進(jìn)行流式數(shù)據(jù)分析。3.3 實驗結(jié)果3.3.1 不同濃度 PMA 刺激下，THP-1 分化后的細(xì)胞形態(tài)

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9 張傳茂;;細(xì)胞分化 中國科學(xué)家談科學(xué)[J];科學(xué)觀察;2007年06期

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8 ;美試驗用腫瘤細(xì)胞治中風(fēng)[N];新華每日電訊;2000年

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