甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是人群當(dāng)中季節(jié)性流感流行和偶發(fā)的大流行的主要病原體,擁有廣泛的宿主范圍和變異程度,能夠感染種類繁多的鳥類和哺乳動(dòng)物,給人類社會(huì)帶來嚴(yán)重危害。甲型流感病毒(IAV)是正黏科病毒(Orthomyxoviridae),基因組由八條單義負(fù)鏈RNA組成,編碼包括核蛋白(Nucleoprotein,NP)、神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)、血凝素(Hemagglutinin,HA)在內(nèi)的十多種蛋白。根據(jù)其表面糖蛋白HA和NA的抗原特異性,甲型流感病毒可以進(jìn)一步分成多種亞型。甲型流感病毒的不同亞型在感染人體后引起不同的致病表現(xiàn)型。當(dāng)病毒入侵宿主后,病毒蛋白會(huì)和宿主蛋白相互作用操縱宿主信號(hào)通路以利于自身復(fù)制和生存。在宿主眾多的信號(hào)通路中,NF-κB信號(hào)通路是比較重要的抗病毒信號(hào)通路。當(dāng)病原微生物入侵人體時(shí),病原微生物的毒力蛋白或者遺傳物質(zhì)充當(dāng)配體與細(xì)胞表面的受體相結(jié)合,通過一系列的接頭蛋白將信號(hào)傳遞給IKK復(fù)合物,被活化的IKK復(fù)合物會(huì)激活I(lǐng)κB,使IκB泛素化降解,然后與核因子κB解離。核因子進(jìn)入細(xì)胞核,結(jié)合相關(guān)基因,促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄,使宿主細(xì)胞表達(dá)出抗病毒的細(xì)胞因子,以此實(shí)現(xiàn)抗病毒的效果。NF-κB信號(hào)通路存在于幾乎所有的動(dòng)物細(xì)胞中,是信號(hào)通路研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。病毒蛋白和宿主蛋白之間的直接相互作用為流感病毒入侵宿主引起復(fù)雜的病理狀況提供了基礎(chǔ)。甲型流感病毒的不同亞型在感染人體后引起不同的致病表現(xiàn)型是因?yàn)椴煌瑏喰偷牧鞲胁《九c宿主信號(hào)通路的關(guān)系不同,即不同流感病毒的不同蛋白和人體信號(hào)通路相互作用產(chǎn)生不同的生理效應(yīng)。我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來探索流感病毒蛋白和NF-κB信號(hào)通路關(guān)系以及相互作用位點(diǎn)的差異來驗(yàn)證我們的猜想。在我們的實(shí)驗(yàn)中,我們選取了H5N1和H1N1亞型流感病毒的兩組蛋白神經(jīng)氨酸酶NA和核蛋白NP,通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)確定病毒蛋白和NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系以及病毒蛋白影響NF-κB信號(hào)通路的可能位點(diǎn),隨后我們利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確定病毒蛋白影響NF-κB信號(hào)通路的具體位點(diǎn)。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1、H5N1和H1N1亞型流感病毒的NP蛋白和NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系存在差異H5N1亞型流感病毒的NP蛋白抑制NF-κB信號(hào)通路,作用位點(diǎn)在TAK1與IKKα處。H5N1亞型流感病毒的NP蛋白抑制TN F-α介導(dǎo)的NF-κB-1uc轉(zhuǎn)錄活性;免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示H5N1亞型流感病毒的NP蛋白增加IκBα的蛋白表達(dá)水平,抑制IκBα的磷酸化;免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示H5N1亞型流感病毒的NP蛋白抑制p65蛋白入核,以上結(jié)果說明H5N1亞型流感病毒的NP蛋白抑制NF-κB信號(hào)通路。H5N1亞型流感病毒的NP蛋白抑制TAK復(fù)合物和IKKα蛋白介導(dǎo)的NF-κB-1uc轉(zhuǎn)錄活性,與TAK1以及IKKα 具有相互作用且抑制IKKα的磷酸化,說明H15N1亞型流感病毒的NP蛋白抑制NF-κB信號(hào)通路的作用位點(diǎn)在TAK1與IKKα處。H1N1亞型流感病毒的NP蛋白對(duì)NF-κB信號(hào)通路沒有影響。H1N1亞型流感病毒的NP蛋白不影響TNF-α介導(dǎo)的NF-κB-Iuc轉(zhuǎn)錄活性,對(duì)IκBα的蛋白表達(dá)水平和IκBα的磷酸化以及p65蛋白的核轉(zhuǎn)位沒有影響說明H1N1亞型流感病毒的NP蛋白對(duì)NF-κB信號(hào)通路沒有影響。2、H5N1和H1N1亞型流感病毒的NA蛋白和NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系也存在差異H5N1亞型流感病毒的NA蛋白激活NF-κB 號(hào)通路,作用位點(diǎn)在TAB2處。H5N1亞型流感病毒的NA蛋白上調(diào)IL-1β介導(dǎo)的NF-κB-1uc轉(zhuǎn)錄活性,說明H5N1亞型流感病毒的NA蛋白激活NF-κB信號(hào)通路。H5N1亞型流感病毒的NA蛋白增強(qiáng)TAK復(fù)合物介導(dǎo)的NF-κB-Iuc轉(zhuǎn)錄活性,與TAB2蛋白具有直接相互作用,說明H5N1亞型流感病毒的NA蛋白激活NF-κB信號(hào)通路的作用位點(diǎn)在TAB2處。H1N1亞型流感病毒的NA蛋白抑制NF-κB信號(hào)通路,作用位點(diǎn)在IKKβ處。H1N1亞型流感病毒的NA蛋白抑制IL-1β介導(dǎo)的NF-κB-Iuc轉(zhuǎn)錄活性說明H1N1亞型流感病毒的NA蛋白抑制NF-κB信號(hào)通路。H1N1亞型流感病毒的NA蛋白抑制TAB2和IKKβ介導(dǎo)的NF-κB-Iuc轉(zhuǎn)錄活性,與IKKβ具有直接相互作用,說明H1N1亞型流感病毒的NA蛋白抑制NF-κB信號(hào)通路的作用位點(diǎn)在IKKβ處。結(jié)果一和結(jié)果二的對(duì)比,驗(yàn)證了我們的猜想不同流感病毒的不同蛋白和人體信號(hào)通路相互作用產(chǎn)生不同的生理效應(yīng),即流感病毒和宿主蛋白相互作用具有亞型特異性特征,其可響應(yīng)不同亞型的流感病毒的特定致病機(jī)制。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析也表明流感病毒的不同亞型可以影響NF-κB信號(hào)通路是否抗病毒以及抗病毒的能力。
【學(xué)位單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R373.13
【部分圖文】：

（ｓｅｇｍｅｎｔ）構(gòu)成，其中甲型和乙型流感病毒基因組都含有八個(gè)ＲＮＡ節(jié)段，而丙型逡逑和丁型流感病毒僅含有七個(gè)節(jié)段［９］。本文的研宄對(duì)象為甲型流感病毒的重要亞逡逑型，以下流感病毒如未特別指明即為甲型流感病毒。甲型流感病毒結(jié)構(gòu)如圖１逡逑所示，八個(gè)ＲＮＡ節(jié)段構(gòu)成的基因組編碼轉(zhuǎn)錄１０種病毒必需蛋白質(zhì)和幾種菌株逡逑村丨關(guān)（ｓｔｒａｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）的輔助蛋白｜｜（）），共計(jì)可達(dá)丨８種。ＲＮＡ節(jié)段１編碼病毒聚逡逑介酶堿性蛋白邋２（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ邋Ｂａｓｉｃ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋２，邋ＰＢ２）和邋ＰＢ２－Ｓ１，邋ＰＢ２邋通過與宿主逡逑ｍＲＮＡｃａｐｓ結(jié)合，在病毒ｍＲＮＡ轉(zhuǎn)錄起始階段發(fā)揮著重要作用，ＰＢ２－Ｓ１通過逡逑病毒轉(zhuǎn)錄后選擇性剪接得到的ｍＲＮＡ翻譯產(chǎn)生，能夠抑制ＲＩＧ－Ｉ依賴的信號(hào)通逡逑路丨１１】。ＲＮＡ節(jié)段２編碼聚合酶堿性蛋白ｌ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ邋Ｂａｓｉｃ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋１，ＰＢ１），ＰＢ１逡逑作為ＲＮＡ依賴的ＲＮＡ聚合酶，在ＲＮＡ聚合酶復(fù)合物中起著促進(jìn)新生病毒ｍＲＮＡ逡逑延伸的作用

圖１．３邋ＮＦ－ｋＢ家族蛋白結(jié)構(gòu)（引自［４６］）逡逑（２）邋ＩｋＢ當(dāng)科學(xué)界最初發(fā)現(xiàn)ＮＦ－ｋＢ時(shí)，認(rèn)為它僅存在于Ｂ細(xì)胞中，后續(xù)逡逑研宄發(fā)現(xiàn)在別的細(xì)胞中也能檢測(cè)到ＮＦ－ｋＢ，科學(xué)家最初以為ＮＦ－ｋＢ是持續(xù)性激逡逑活的，然而在之后的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中存在一種物質(zhì)能夠抑制ＮＦ－ｋＢ的活性，逡逑這一物質(zhì)就是核因子ｋＢ抑制劑（ＩｋＢ），它會(huì)在ＮＦ－ｋＢ激活的時(shí)候失活ｔ４７］。目前逡逑研宄發(fā)現(xiàn)邋ＩｋＢ邋家族有邋ＩｉｃＢａ、ＩｉｃＢｐ、ＩｋＢｓ、ＩｋＢＤＬ、ＩｋＢＲ、ｐｌ０５、ｐｌＯＯ、ＩｉｃＢｙ邋八逡逑個(gè)成員，其中ＩＫＢａ分子量為３７１ｃＤａ，它的活性會(huì)被ＩｋＢ激酶復(fù)合物的不同亞基逡逑抑制，ＩｋＢＰ分子量為４３ｋＤａ，當(dāng)使用磷酸化處理時(shí)，ＩｋＢＰ與核因子ｋＢ結(jié)合的逡逑活性會(huì)被抑制，ＩｋＢｓ控制Ｒｅｌ／ＮＦ－ＫＢ轉(zhuǎn)錄復(fù)合物子集的活性，ＩｋＢＤＬ和ＩｋＢＲ與逡逑ＮＦ－ｋＢ活性調(diào)節(jié)的相關(guān)性仍然不確定，ｐｌ０５和ｐｌＯＯ是核因子ｋＢ的前體物質(zhì)，逡逑以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中［４８］。逡逑ＩｋＢ家族中的所有亞基都存在錨蛋白重復(fù)序列，在蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用逡逑中具有重要作用。丨ｋＢ和ＮＦ－ｋＢ的相互作用的過程中也會(huì)用到錨蛋白重復(fù)序列。逡逑

Ｐｎｆ＾ｂ５ｉ°邐＝＃｜ＥＺ＾ＩＩＭ＝＾＾：＝３ＱＱＱＱａ＝ＱＱ：＾￣－—逡逑圖１．３邋ＮＦ－ｋＢ家族蛋白結(jié)構(gòu)（引自［４６］）逡逑（２）邋ＩｋＢ當(dāng)科學(xué)界最初發(fā)現(xiàn)ＮＦ－ｋＢ時(shí)，認(rèn)為它僅存在于Ｂ細(xì)胞中，后續(xù)逡逑研宄發(fā)現(xiàn)在別的細(xì)胞中也能檢測(cè)到ＮＦ－ｋＢ，科學(xué)家最初以為ＮＦ－ｋＢ是持續(xù)性激逡逑活的，然而在之后的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中存在一種物質(zhì)能夠抑制ＮＦ－ｋＢ的活性，逡逑這一物質(zhì)就是核因子ｋＢ抑制劑（ＩｋＢ），它會(huì)在ＮＦ－ｋＢ激活的時(shí)候失活ｔ４７］。目前逡逑研宄發(fā)現(xiàn)邋ＩｋＢ邋家族有邋ＩｉｃＢａ、ＩｉｃＢｐ、ＩｋＢｓ、ＩｋＢＤＬ、ＩｋＢＲ、ｐｌ０５、ｐｌＯＯ、ＩｉｃＢｙ邋八逡逑個(gè)成員，其中ＩＫＢａ分子量為３７１ｃＤａ，它的活性會(huì)被ＩｋＢ激酶復(fù)合物的不同亞基逡逑抑制，ＩｋＢＰ分子量為４３ｋＤａ，當(dāng)使用磷酸化處理時(shí)，ＩｋＢＰ與核因子ｋＢ結(jié)合的逡逑活性會(huì)被抑制，ＩｋＢｓ控制Ｒｅｌ／ＮＦ－ＫＢ轉(zhuǎn)錄復(fù)合物子集的活性，ＩｋＢＤＬ和ＩｋＢＲ與逡逑ＮＦ－ｋＢ活性調(diào)節(jié)的相關(guān)性仍然不確定

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