發(fā)布時(shí)間：2020-09-22 12:35

　　 目的:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)患者通常具有與胃腸道(Gastrointestinal,GI)功能障礙相關(guān)的非運(yùn)動(dòng)癥狀,如便秘和胃排空延遲等,并且PD患者的非運(yùn)動(dòng)癥狀在運(yùn)動(dòng)癥狀發(fā)作前多年出現(xiàn)。至今,關(guān)于PD確切的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,遺傳因素、環(huán)境因素、氧化應(yīng)激等均可能參與PD的進(jìn)展。有研究結(jié)果顯示,腸道菌群的變化可能與PD的發(fā)病機(jī)制有關(guān),然而尚不完全清楚GI功能障礙和腸道菌群失調(diào)在PD中是如何發(fā)生的。鑒于GI功能障礙和腸道菌群在PD中的重要作用,我們研究了由慢性低劑量MPTP誘導(dǎo)的PD神經(jīng)毒素模型是否能夠再現(xiàn)PD的腸道病理特征,以及腸道菌群失調(diào)是否伴隨該病理特征出現(xiàn)。方法:40只10周齡C57BL/6雄性小鼠經(jīng)腹腔注射18mg/kg MPTP,每周兩次,持續(xù)5周。通過測(cè)量1小時(shí)排便頻率和糞便含水量來評(píng)估小鼠GI功能;通過爬桿實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠的運(yùn)動(dòng)功能;通過蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting,WB)、免疫熒光(Immunofluorescence,IF)檢測(cè)了小鼠黑質(zhì)(Substantia nigra,SN)和回腸中酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)和Alpha-突觸核蛋白(Alpha-synuclein,α-syn)的表達(dá)水平;通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)檢測(cè)了小鼠紋狀體和回腸中多巴胺(Dopamine,DA)含量;通過IF、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)了小鼠SN的炎癥表達(dá);通過免疫組化(Immunofluorescence,IHC)、ELISA檢測(cè)了小鼠回腸的炎癥表達(dá);通過ELISA測(cè)定血清中二胺氧化酶(Diamine oxidase,DAO)和D-乳酸(D-lactic acid,D-LA)的水平來評(píng)估小鼠腸屏障受損情況;此外,還通過高通量測(cè)序檢測(cè)小鼠腸道菌群的組成情況。結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)MPTP在引起小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙之前就已引起GI功能障礙;PD小鼠SN和回腸的TH和α-syn表達(dá)減少;PD小鼠紋狀體和回腸中的DA含量降低;MPTP引起小鼠SN和回腸中的炎癥表達(dá);PD小鼠的DAO和D-LA表達(dá)增加,表明其腸屏障已受損;高通量測(cè)序結(jié)果顯示PD小鼠的腸道菌群組成發(fā)生了變化,特別是毛螺菌科、丹毒絲菌科、普雷沃氏菌科、梭菌目、丹毒絲菌目和變形菌門的豐度變化非常顯著。結(jié)論:研究結(jié)果表明,慢性低劑量MPTP模型可用于評(píng)估PD早期階段的腸道病理和腸道微生物失調(diào)的具體進(jìn)展,這可能為PD的發(fā)病機(jī)制提供新的見解,并為從改善胃腸道健康的方面治療PD提供新的思路。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R742.5;R-332
【部分圖文】：

圖 2 MPTP 誘導(dǎo)小鼠的 GI 功能障礙（mean ±SD, n=5）A：1 小時(shí)排便頻率； B：糞便含水量Fig. 2 MPTP induces GI dysfunction.A: 1-hour fecal pellets; B: percent fecal water content over the course of the study.Note：*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.0013.2 MPTP 降低小鼠紋狀體和回腸中的 DA 含量DA 的濃度表明 DA 能神經(jīng)元合成和釋放 DA 的能力，它同時(shí)可以反映 DA 能神經(jīng)元的受損程度。紋狀體 DA 結(jié)果顯示，在末次給藥后的 2 天和 3 周這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠的紋狀體 DA 水平與各自對(duì)照組小鼠相比顯著降低了 41.5 %和 13.3 %，并且實(shí)驗(yàn)組小鼠的DA在末次給藥后3周的含量明顯高于末次給藥后2天的含量（圖3A）。

圖 3 MPTP 降低小鼠紋狀體（A）和回腸（B）中的 DA 含量（mean ±SD, n=3）Fig. 3 MPTP reduces the DA content in the striatum （A） and ileum （B）.Note：***P < 0.001.3.3 MPTP 影響小鼠 SN 中的 TH 和 α-syn 表達(dá)TH 是 DA 合成的限速酶。為了研究 MPTP 對(duì) DA 能神經(jīng)元和 TH 表達(dá)在 SN中的影響，利用 WB 和 IF 實(shí)驗(yàn)來展現(xiàn) TH 表達(dá)的具體情況。SN 的 WB 結(jié)果顯示，與相應(yīng)對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠在末次給藥后 2 天和 3 周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的 TH 表達(dá)都顯著降低；另外，實(shí)驗(yàn)組在末次給藥后 3 周的 TH 表達(dá)低于末次給藥后 2 天的表達(dá)（圖 4A）。 IF 結(jié)果顯示，與相應(yīng)的對(duì)照組小鼠比較，MPTP 末次給藥后 2 天和 3周小鼠的 TH 免疫反應(yīng)性均顯著降低，并且隨著時(shí)間的推移，降低的趨勢(shì)更加明顯

圖 4 MPTP 影響 SN 中 TH 和 α-syn 的表達(dá)A：黑質(zhì)的 TH 和 α-syn 在 WB 中的表達(dá)； B：SN 中 TH 在 IF 中的表達(dá)，比例尺是 200 μmC：SN 中 α-syn 在 IF 中的表達(dá)，比例尺是 50 μmFig. 4 MPTP influences TH and α-syn expression in the SN.A: Representative WB of nigral TH and α-syn expression; B: Representative IF staining foTH in the SN. Scale bar is 200 μm; C: Representative IF staining for α-syn in the SN. Scale bis 50 μm.3.4 MPTP 影響小鼠回腸中的 TH 和 α-syn 表達(dá)同樣地，我們檢測(cè)了回腸中 TH 和 α-syn 的表達(dá)情況。WB 結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)小鼠在末次給藥后 2 天和 3 周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的 TH 表達(dá)與相應(yīng)的對(duì)照組相比，都有定的增加，并且在末次給藥后 2 天的增加趨勢(shì)比后 3 周更明顯（圖 5A）。IF 結(jié)

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