主要來源于巨噬細胞的促炎因子IL-1β和IL-18,在宿主防御感染和炎性疾病中扮演著重要的角色。生物活性的IL-1β和IL-18需要細胞內(nèi)天冬半胱氨酸蛋白酶caspase-1將無活性的前體proIL-1β和proIL-18裂解,這個過程受到不同的炎癥小體的調(diào)控。NLRP3炎癥小體是目前最有代表性的炎癥小體,由NLRP3、銜接蛋白ASC、caspase-1構(gòu)成的蛋白復(fù)合體。NLRP3炎癥小體失調(diào)會導(dǎo)致多種多樣的炎性綜合征的發(fā)生,包括多發(fā)性硬化(MS)、心血管疾病、神經(jīng)退行性變、痛風和肥胖等。因此,維持NLRP3炎癥小體活化與抑制的最佳平衡才能避免對機體造成過度的炎性損傷。NLRP3炎癥小體的激活屬于雙信號模式,其中啟動信號主要來源于模式識別受體(PRRs),激活NF-κB信號通路和MAPK信號通路用于上調(diào)NLRP3炎癥小體組件的轉(zhuǎn)錄水平;第二信號又被稱為激活信號,由ATP、孔形成、K~+外流、溶酶體不穩(wěn)定/破裂、線粒體活性氧(mtROS)等多種刺激激活。一旦NLRP3炎癥小體活化后,caspase-1裂解proIL-1β和proIL-18,產(chǎn)生具有生物活性的IL-1β和IL-18,從而促進炎癥或誘導(dǎo)炎性細胞的死亡(即焦亡)。NLRP3炎癥小體的蛋白水平被認為是炎癥小體激活的關(guān)鍵限速點,受多種調(diào)節(jié)機制抑制,如自噬的產(chǎn)生、T細胞的活化、I型干擾素的表達、一氧化氮(NO)、TRIM30(tripartite-motif protein 30)、POP1(pyrin-only protein-1)和miR-233等等,這些調(diào)節(jié)因子可以直接抑制NLRP3蛋白的表達,減少炎癥小體的激活。例如,2型纖溶酶原激活物通過增加NLRP3的自噬性降解從而減少NLRP3表達。A20(也被稱作TNFAIP3)可通過限制proIL-1β和NLRP3蛋白的泛素化從而抑制NLRP3炎癥小體的活化。已報道的這些調(diào)節(jié)因子大多數(shù)看起來都是作用于轉(zhuǎn)錄后和翻譯后調(diào)節(jié),但是關(guān)于NLRP3炎癥小體轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)仍然是不清楚的。VSIG4(V-set and immunoglobulin domain-containing 4)是免疫球蛋白超家族補體受體(CRIg),特異性的表達于靜息的組織定居巨噬細胞。通過與補體成分C3b或失活的C3b(iC3b)結(jié)合,VSIG4可清除C3b或iC3b調(diào)理的病原體,包括單核細胞增多性李斯特菌和金黃色葡萄球菌。VSIG4與T細胞上未知受體結(jié)合后可抑制T細胞增殖并促進Foxp3~+T_(reg)細胞分化。VSIG4-Fc融合蛋白似乎也可防止實驗性自身免疫性關(guān)節(jié)炎、肝炎、葡萄膜視網(wǎng)膜炎的發(fā)展。然而,VSIG4是否能對NLRP3炎癥小體組分的轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控依舊未知。為了明確VSIG4與NLRP3炎癥小體之間的關(guān)系,我們首先在體外證實了VSIG4缺失后Nlrp3和Il-1β的轉(zhuǎn)錄水平增強。靜息狀態(tài)時,Vsig4~(-/-)腹腔巨噬細胞(PEMs)中,Nlrp3和Il-1β的mRNA水平升高,但Asc、Caspase-1及Il-18無明顯的變化。給予PEMs第一信號(LPS刺激)后,敲除VSIG4后NLRP3和IL-1β蛋白水平增高,同時過表達VSIG4則NLRP3和IL-1β蛋白水平降低。給予PEMs第一信號和第二信號后,VSIG4敲除不影響caspase-1及活化形式的蛋白水平,但細胞分泌的IL-1β增加、細胞焦亡增多。直接使用C3b刺激人來源的單核細胞THP-1或VSIG4激動性抗體VG11活化野生型小鼠PEMs中VSIG4,可抑制IL-1β分泌和細胞焦亡的發(fā)生。VSIG4又是如何影響NLRP3和IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平的呢?為了明確其分子機制,我們在Vsig4~(-/-)PEMs和肝臟組織中發(fā)現(xiàn)A20蛋白水平明顯下降,同時過表達Vsig4的PEMs中A20表達也明顯增強。已有文獻報道A20參與NLRP3和proIL-1β的蛋白表達,因此我們用shRNA干擾A20表達后發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路增強、NLRP3及IL-1β表達增加,BAY11-7082抑制NF-κB后下調(diào)NLRP3及IL-1β表達,說明VSIG4通過A20-NF-κB通路抑制NLRP3炎癥小體。進一步分析Nlrp3和Il-1β的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)許多RelA(即NF-κB p-65)、JunB和ELK-1的結(jié)合位點,RelA可直接調(diào)控JunB和ELK-1的表達和磷酸化水平,同時JunB和ELK-1在LPS刺激條件下與Nlrp3和Il-1β的啟動子區(qū)域結(jié)合促進其轉(zhuǎn)錄表達。接著我們檢索了A20基因啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,發(fā)現(xiàn)許多STATs轉(zhuǎn)錄因子的序列,WB(western blot)顯示p-STAT3及上游分子p-JAK2表達增高,而p-STAT6、p-AKT、p-ERK1/2無明顯變化。shRNA干擾Stat3、S3I-201抑制STAT3或TG101348抑制JAK2后,均會抑制A20表達,從而影響下游NLRP3和IL-1β的表達。進一步通過ChIP-qPCR確定p-STAT3結(jié)合在A20啟動子上-1000~+1區(qū)域。這些結(jié)果表明VSIG4會通過JAK2-STAT3-A20信號軸抑制NF-κB信號對NLRP3炎癥小體的活化。VSIG4作為膜分子,又是如何啟動JAK2-STAT3-A20信號的呢?為此,我們采用酵母泛素分裂篩選的方法找到了與VSIG4交互蛋白MS4A6D分子,通過免疫熒光共定位和CO-IP進一步證實兩者可相互作用。進一步通過CO-IP證實MS4A6D直接與JAK2相互作用,使JAK2磷酸化水平升高,提高下游p-STAT3及A20蛋白水平,抑制Nlrp3和Il-1β的轉(zhuǎn)錄表達。在Vsig4~+RAW264.7細胞中過表達Ms4a6d后增強JAK2-STAT3-A20信號,同時Vsig4~+RAW264.7細胞中shRNA干擾Ms4a6d則抑制JAK2-STAT3-A20信號。最后通過截短和點突變的方法證實,VSIG4與MS4A6D相互作用時MS4A6D碳端231-241位上Ser~(232)和Ser~(235)磷酸化是活化下游信號所必須。這些結(jié)果都表明了激活VSIG4后與MS4A6D相互作用,使MS4A6D直接磷酸化JAK2并啟動STAT3-A20信號抑制NLRP3炎癥小體。在體外實驗中,VSIG4參與NLRP3炎癥小體的調(diào)控,那么VSIG4在NLRP3炎癥小體相關(guān)疾病中是否也同樣參與NLRP3炎癥小體調(diào)控呢?因此,我們構(gòu)建了與NLRP3炎癥小體活化緊密相關(guān)的兩個動物模型——實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型以及葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的腸炎模型。在EAE模型中,VSIG4敲除小鼠疾病癥狀加重,炎性細胞浸潤增多,包括與EAE脫髓鞘緊密相關(guān)的IL-17A~+CD4~+T細胞及IFN-γ~+CD4~+T細胞增加,并且NLRP3和IL-1β蛋白表達增加。同時在Vsig4~(-/-)Nlrp3~(-/-)小鼠和Vsig4~(-/-)Il-1r1~(-/-)小鼠或IL-1Rα(IL-1受體阻斷劑)處理的Vsig4~(-/-)小鼠中,EAE疾病癥狀減輕,說明在EAE模型中VSIG4通過負調(diào)NLRP3炎癥小體活化從而減輕疾病嚴重程度。然而,在DSS誘導(dǎo)的腸炎模型中,Vsig4~(-/-)小鼠表現(xiàn)出對腸炎的抵抗性。VSIG4敲除后小鼠存活率提高、體重下降幅度減輕、疾病評分降低、炎性細胞浸潤減少,但NLRP3和IL-1β表達增加、腸上皮增殖能力增強,說明VSIG4缺失使NLRP3炎癥小體激活并保護DSS誘導(dǎo)的腸炎。進一步使用Vsig4~(-/-)Il-1r1~(-/-)小鼠構(gòu)建腸炎模型,能明顯阻斷VSIG4缺失后的保護作用,同時使用CY-09(NLRP3抑制劑)和IL-1Rα處理Vsig4~(-/-)腸炎小鼠印證了該結(jié)果。這些結(jié)果表明在VSIG4抑制NLRP3炎癥小體及IL-1β信號從而加重DSS誘導(dǎo)的腸炎。既然VSIG4在NLRP3炎癥小體相關(guān)疾病中扮演者重要的角色,那是否能將其作為疾病的治療靶點,從疾病初期就減少甚至阻斷NLRP3炎癥小體的過度活化。因此我們使用VSIG4的單克隆激動性抗體VG11處理EAE野生型小鼠,相對于IgG1對照小鼠,給予VG11處理的小鼠癥狀明顯減輕、炎性細胞浸潤減少,同時促進JAK2-STAT3-A20信號活化、下調(diào)下游NLRP3及IL-1β表達。由此說明,VSIG4可以作為NLRP3炎癥小體相關(guān)疾病的治療靶點。總之,VSIG4活化時可與MS4A6D相互作用,直接激活下游JAK2-STAT3-A20級聯(lián)信號,進而抑制Nlrp3和Il-1β的表達,負調(diào)NLRP3炎癥小體的活化。VSIG4活化信號參與調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體相關(guān)的疾病,為治療該類疾病提供了潛在的新靶點。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

陸軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文果狀態(tài)下，VSIG4 缺失上調(diào) NLRP3 和 IL-1β 的 mRNA 和蛋 VSIG4 是否能調(diào)控 NLRP3 炎癥小體信號，我們分離出 C/-小鼠腹腔巨噬細胞（PEMs），通過 qPCR 分析兩組之間 mRNA 的表達情況。發(fā)現(xiàn) VSIG4 敲除后 Nlrp3 和 Il-1βSC、Il-18 兩組之間無明顯差異（圖 2-1）。進一步，通過 W/-小鼠 PEMs 發(fā)現(xiàn)，VSIG4 缺失導(dǎo)致 NLRP3 及 proIL-1β 蛋

-1、ASC、Il-18 兩組之間無明顯差異（圖 2-1）。進一步，通過 WB 分Vsig4-/-小鼠 PEMs 發(fā)現(xiàn)，VSIG4 缺失導(dǎo)致 NLRP3 及 proIL-1β 蛋白水平圖 2-1 靜息狀態(tài)下，VSIG4 抑制 Nlrp3 和 Il-1β 表達Figure 2-1 VSIG4 inhibits the expression of Nlrp3 and Il-1βPCR analysis of mRNA transcription encoding for NLRP3 inflammasome comporesents an individual mouse, and five mouse in each group).NS, not significant. *P1 (Student’s t test). Data represent one out of three biological replicates, with thr each at least.

現(xiàn) VSIG4 敲除后 NLRP3 及 proIL-1β 蛋白水平表達增強（圖 2-2 左）。為了排除 PEM存在的異質(zhì)性，我們采用 VSIG4 過表達的 RAW264.7 細胞進一步分析，發(fā)現(xiàn) VSIG抑制 RAW264.7 細胞中 NLRP3 和 proIL-1β 的蛋白水平，包括基礎(chǔ)水平和 LPS 刺激后水平（圖 2-2 右）。2.3.3 VSIG4 啟動抑制信號特異性的下調(diào)巨噬細胞中 Nlrp3 和 Il-1β 表達補體蛋白 C3b 是 VSIG4 的天然配體，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）可以看出PEMs 和 RAW264.7 細胞系培養(yǎng)上清中均有 C3，且 LPS 刺激細胞后可促進 C3 的分泌說明 C3 裂解產(chǎn)物 C3b 可能與巨噬細胞上的 VSIG4 相互作用（圖 2-3 左）。為了驗證這猜測，我們使用佛波酯（PMA）處理 THP-1 細胞系（人單核細胞系）分化為巨噬細胞加入 C3b 后可降低 LPS 刺激所致 NLRP3 和 proIL-1β 表達（圖 2-3 右）。為了進一步驗證該結(jié)果，我們自制抗小鼠 VSIG4 的活化性抗體 VG11，該抗體可識別VSIG4蛋白（圖2-4左）。VG11單抗處理PEMs后同樣可抑制 LPS刺激所致NLRP和 proIL-1β 表達（圖 2-4 右）。

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本文編號：2824083