造血干細胞(Hematopoietic stem cell,HSC)通常被認為是造血系統(tǒng)的基石,在生物體整個生命周期中具有持續(xù)產(chǎn)生所有成熟血細胞的功能,并能夠完全重建成體的造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng),是研究歷史最長且最為深入的成體干細胞之一。HSC移植常用于臨床治療多種血液系統(tǒng)疾病、遺傳性疾病、某些實體瘤和自身免疫性疾病等,具備較好的治療效果。但是,由于HSC來源受限及體外擴增困難等問題使得很多病人失去了接受治療的機會。為了解決這些問題,研究嘗試利用多能干細胞定向誘導分化形成HSC,然而對于HSC發(fā)育的基本規(guī)律和調(diào)控機制缺乏系統(tǒng)性的科學認識,使得體外誘導HSC再生至今仍未成功。因此探索HSC的發(fā)生發(fā)育規(guī)律和調(diào)控機制就表現(xiàn)得尤為重要。在小鼠胚胎發(fā)育期第10.5天(embryonic day 10.5,E10.5),產(chǎn)生了第一個能夠長期重建成體造血系統(tǒng)的HSC,它的起源包括卵黃囊(Yolk sac,YS)、頭部和主動脈-性腺-中腎區(qū)(Aorta-gonad-mesonephros,AGM)等多個血管位點。近年來研究發(fā)現(xiàn)其中最重要的生血位點AGM區(qū)的HSC是由生血內(nèi)皮細胞經(jīng)過內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化(Endothelial-hematopoietic transition,EHT)的過程,然后產(chǎn)生Ⅰ型造血干細胞前體和Ⅱ型造血干細胞前體等兩類造血干細胞前體(pre-hematopoietic stem cell,pre-HSC),并進一步發(fā)育成熟為HSC。并且,由于HSC發(fā)育時間窗持續(xù)時間有限,pre-HSC和HSC等這些發(fā)育過程中重要的細胞群體數(shù)量是非常稀少的,且缺乏有效富集這些細胞群體的特異性表面標志分子,這些特點使得探索HSC起源規(guī)律及解析深層次的調(diào)控機制顯得異常困難。迄今為止,雖然有不少研究報道了小鼠胚胎期HSC發(fā)育中所參與的調(diào)控分子,但是已知的一些研究僅僅集中在信號通路及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用,如轉(zhuǎn)錄因子Runx1(及其下游轉(zhuǎn)錄因子Gfi1和Spi1)、Gata2等對于內(nèi)皮向造血轉(zhuǎn)化必不可少;轉(zhuǎn)錄因子Hoxa3一方面通過抑制重要造血轉(zhuǎn)錄因子的表達,另一方面通過促進內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)錄因子表達來維持內(nèi)皮細胞的內(nèi)皮特性,抑制內(nèi)皮向造血轉(zhuǎn)化;轉(zhuǎn)錄協(xié)同分子Smad4也同樣被證實負調(diào)控了該過程。另外,信號通路如BMP/TGF-β、Notch、Wnt、TNF-α和Hedgehog在內(nèi)皮向造血轉(zhuǎn)化中都發(fā)揮著重要的作用。與研究相對透徹的編碼基因和信號通路相比,長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)在HSC發(fā)育過程中的動態(tài)表達圖譜及生理功能至今還沒有報道。既往研究在國際上首次建立單個細胞的孵育誘導移植實驗體系并通過大規(guī)模的篩選多種表面標志組合發(fā)現(xiàn)特異性表面標志CD201,并實現(xiàn)pre-HSC高達30%的精準捕獲。同時結(jié)合單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),系統(tǒng)揭示了HSC完整生命周期中相關(guān)群體的動態(tài)分子表達規(guī)律,實現(xiàn)了單細胞水平的精準研究�；谝陨螲SC發(fā)育全程單細胞轉(zhuǎn)錄組的高通量測序數(shù)據(jù),本研究進一步經(jīng)過系統(tǒng)性生物信息學分析,鑒定出該六種細胞群體里共有7312個lncRNA,首次描繪出HSC發(fā)育全程的單細胞lncRNA的動態(tài)表達圖譜,并系統(tǒng)揭示了lncRNA在六個連續(xù)發(fā)育的細胞群體中的時空表達、與鄰近蛋白編碼基因相關(guān)性、階段特異性基因等方面的表達特征,而且還通過與重要蛋白編碼基因的基因座共定位或共表達來預(yù)測相關(guān)lncRNA的生理功能。Pearson相關(guān)性分析顯示lncRNA與其鄰近的第一個蛋白編碼基因相關(guān)性最強,主成分分析(Principal components analysis,PCA)表明lncRNA比mRNA更易于區(qū)別不同時空相似的細胞群體,揭示在造血干細胞發(fā)育過程中l(wèi)ncRNA可能具有更強的階段特異性,進一步提示lncRNA在整個過程中發(fā)揮了重要作用。同時,針對研究分析出的401個全新的未注釋的lncRNA進行了PCR和Sanger測序并鑒定出了一系列真實存在于HSC發(fā)育過程中全新未注釋的lncRNA分子,進一步證實lncRNA調(diào)控HSC發(fā)育的潛在重要功能。后續(xù)按照三個嚴格的生物信息學分析篩選標準篩選出10個潛在的功能性候選lncRNA,并通過體外集落培養(yǎng)功能實驗(Colony forming units in culture,CFU-C)發(fā)現(xiàn)6個可能在胚胎造血發(fā)育中發(fā)揮作用的lncRNA,這6個lncRNA分別是H19,AI66270,4933439C10Rik,Gm15135,Gm17275和1700113A16Rik。并進一步利用條件性基因敲除的研究策略及AGM直接移植實驗,著重闡明了lncRNA-H19對于AGM區(qū)HSC發(fā)生至關(guān)重要,單細胞轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)lncRNA-H19缺失后重要造血轉(zhuǎn)錄因子Runx1和Spi1的表達顯著下調(diào),假時序分析也證明lncRNA-H19缺失后阻滯了內(nèi)皮向造血轉(zhuǎn)化這一階段。全基因組甲基化高通量測序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)lncRNA-H19的缺失使得重要造血轉(zhuǎn)錄因子(包括Runx1及Spi1等)的啟動子區(qū)域高甲基化,內(nèi)皮細胞特異性表達轉(zhuǎn)錄因子如Sox17的啟動子區(qū)域低甲基化,提示lncRNA-H19可能通過調(diào)控重要造血轉(zhuǎn)錄因子和內(nèi)皮細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的甲基化水平來下調(diào)表達或上調(diào)表達,以致血管內(nèi)皮細胞向pre-HSC的轉(zhuǎn)化受到阻滯。因為lncRNA所在位置決定了它們本身的功能,機制研究發(fā)現(xiàn)胞漿定位的lncRNA-H19部分通過抑制甲基化調(diào)控分子S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase,SAHH)的活性來調(diào)控目的基因的甲基化水平。有趣的是,我們還發(fā)現(xiàn)lncRNA-H19這一作用是獨立于以往報道的lncRNA-H19作為microRNA前體(pri-miR)可能加工產(chǎn)生的產(chǎn)物mir-675而是其本身作用產(chǎn)生的。之前文獻報道m(xù)ir-675分子通過調(diào)控Igf1r-Igf2信號通路來維持成體HSC的靜息狀態(tài)。綜上所述,我們這一研究在國際上首次揭示了HSC發(fā)生過程中發(fā)揮重要功能的lncRNA,并系統(tǒng)闡述了lncRNA-H19在胚胎HSC發(fā)生與成體HSC穩(wěn)態(tài)維持中完全不同的功能以及調(diào)控方式。這些認識將為全面理解lncRNA調(diào)控重要生物學過程的機制提供重要啟示,而且HSC發(fā)育全程的單細胞lncRNA圖譜也將為HSC發(fā)育和再生機制研究提供重要的數(shù)據(jù)庫和參考。
【學位單位】：軍事科學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

圖 2 造血干細胞發(fā)育中全新的未注釋 lncRNA 分析A 熱圖展示造血干細胞發(fā)生中階段特異性的未注釋 lncRNAB 之前報道的 BM HSC 特異性 lncHSC1 和 LncHSC2 在六個細胞群體中的C pre-HSC、FL HSC 和 BM HSC 三個群體中 lncRNA 與 Goodell 數(shù)據(jù)庫比析D lncRNA 與之前兩項報道的比較分析E PCR 和 Sanger 測序驗證未注釋的 lncRNAF 未注釋 lncRNA 驗證結(jié)果和表達情況近年一系列研究證實 lncRNA 可通過調(diào)節(jié)鄰近蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄，精密

圖 3 從單細胞水平分析 lncRNA 與蛋白編碼基因的相關(guān)性A lncRNA 在基因間和基因內(nèi)的分布B lncRNA 與鄰近基因成對 Pearson 相關(guān)性分析C 反式作用中 lncRNA 與鄰近基因的相關(guān)性分析D 順式作用中 lncRNA 與鄰近基因的相關(guān)性分析E 根據(jù)與鄰近基因的基因位置關(guān)系順式中 lncRNA 的分類F 在所用細胞樣品中六種 lncRNA 分布G 六種 lncRNA-mRNA 對的相關(guān)性分析H 代表性 lncRNA-mRNA 正負相關(guān)表達I 不同物種間 lncRNA 保守性分析造血干細胞發(fā)育中 LncRNA 的階段性表達特征為了探索 HSC 發(fā)育過程中 lncRNA 的表達特征，我們首先在測序數(shù)據(jù)中挖9 個差異表達基因（圖 4 A），接著主成分分析顯示 128 個單細胞分成了獨個不同的細胞群體，并能明顯區(qū)分兩個相似相近的發(fā)育階段的細胞群體（

圖 4 HSC 發(fā)育中差異表達 lncRNA 基因和特征性 lncRNA 基因A 差異表達 lncRNA 基因的熱圖展示B lncRNAs 主成分分析C T1、T2 pre-HSC 和 E12 HSC、E14 HSC 四個細胞群體中差異表達lncRNAsD 基于 lncRNA 表達的 qPCR 結(jié)果的主成分分析.3 通過蛋白編碼基因的位置和表達相關(guān)性分析預(yù)測 LncRNA 功能由于在復雜的生理環(huán)境下生理過程中信號通路的激活或者相互作用而引起發(fā)生不同程度的表達，這樣細胞中的基因會形成獨特的基因表達模式，從而這個細胞群體或者生理過程的特征基因，這些特征基因被稱為名片基signature gene），名片基因可以揭示不同細胞群體的特征及功能，還具有預(yù)測。近年來成體骨髓中 HSC 的蛋白編碼基因方面的名片基因已被充分挖掘re-HSC 的蛋白編碼基因的名片基因也通過比較真正 pre-HSC 群體和陰性群體行分析研究。為了進一步獲得與 HSC 潛能相關(guān)的特征性 lncRNA 基因，我們將造血干細

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本文編號：2824062