發(fā)布時間：2020-09-22 07:10

　　 造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cell,HSC)通常被認(rèn)為是造血系統(tǒng)的基石,在生物體整個生命周期中具有持續(xù)產(chǎn)生所有成熟血細(xì)胞的功能,并能夠完全重建成體的造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng),是研究歷史最長且最為深入的成體干細(xì)胞之一。HSC移植常用于臨床治療多種血液系統(tǒng)疾病、遺傳性疾病、某些實(shí)體瘤和自身免疫性疾病等,具備較好的治療效果。但是,由于HSC來源受限及體外擴(kuò)增困難等問題使得很多病人失去了接受治療的機(jī)會。為了解決這些問題,研究嘗試?yán)枚嗄芨杉?xì)胞定向誘導(dǎo)分化形成HSC,然而對于HSC發(fā)育的基本規(guī)律和調(diào)控機(jī)制缺乏系統(tǒng)性的科學(xué)認(rèn)識,使得體外誘導(dǎo)HSC再生至今仍未成功。因此探索HSC的發(fā)生發(fā)育規(guī)律和調(diào)控機(jī)制就表現(xiàn)得尤為重要。在小鼠胚胎發(fā)育期第10.5天(embryonic day 10.5,E10.5),產(chǎn)生了第一個能夠長期重建成體造血系統(tǒng)的HSC,它的起源包括卵黃囊(Yolk sac,YS)、頭部和主動脈-性腺-中腎區(qū)(Aorta-gonad-mesonephros,AGM)等多個血管位點(diǎn)。近年來研究發(fā)現(xiàn)其中最重要的生血位點(diǎn)AGM區(qū)的HSC是由生血內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化(Endothelial-hematopoietic transition,EHT)的過程,然后產(chǎn)生Ⅰ型造血干細(xì)胞前體和Ⅱ型造血干細(xì)胞前體等兩類造血干細(xì)胞前體(pre-hematopoietic stem cell,pre-HSC),并進(jìn)一步發(fā)育成熟為HSC。并且,由于HSC發(fā)育時間窗持續(xù)時間有限,pre-HSC和HSC等這些發(fā)育過程中重要的細(xì)胞群體數(shù)量是非常稀少的,且缺乏有效富集這些細(xì)胞群體的特異性表面標(biāo)志分子,這些特點(diǎn)使得探索HSC起源規(guī)律及解析深層次的調(diào)控機(jī)制顯得異常困難。迄今為止,雖然有不少研究報道了小鼠胚胎期HSC發(fā)育中所參與的調(diào)控分子,但是已知的一些研究僅僅集中在信號通路及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用,如轉(zhuǎn)錄因子Runx1(及其下游轉(zhuǎn)錄因子Gfi1和Spi1)、Gata2等對于內(nèi)皮向造血轉(zhuǎn)化必不可少;轉(zhuǎn)錄因子Hoxa3一方面通過抑制重要造血轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),另一方面通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)來維持內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮特性,抑制內(nèi)皮向造血轉(zhuǎn)化;轉(zhuǎn)錄協(xié)同分子Smad4也同樣被證實(shí)負(fù)調(diào)控了該過程。另外,信號通路如BMP/TGF-β、Notch、Wnt、TNF-α和Hedgehog在內(nèi)皮向造血轉(zhuǎn)化中都發(fā)揮著重要的作用。與研究相對透徹的編碼基因和信號通路相比,長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)在HSC發(fā)育過程中的動態(tài)表達(dá)圖譜及生理功能至今還沒有報道。既往研究在國際上首次建立單個細(xì)胞的孵育誘導(dǎo)移植實(shí)驗體系并通過大規(guī)模的篩選多種表面標(biāo)志組合發(fā)現(xiàn)特異性表面標(biāo)志CD201,并實(shí)現(xiàn)pre-HSC高達(dá)30%的精準(zhǔn)捕獲。同時結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),系統(tǒng)揭示了HSC完整生命周期中相關(guān)群體的動態(tài)分子表達(dá)規(guī)律,實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平的精準(zhǔn)研究�；谝陨螲SC發(fā)育全程單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的高通量測序數(shù)據(jù),本研究進(jìn)一步經(jīng)過系統(tǒng)性生物信息學(xué)分析,鑒定出該六種細(xì)胞群體里共有7312個lncRNA,首次描繪出HSC發(fā)育全程的單細(xì)胞lncRNA的動態(tài)表達(dá)圖譜,并系統(tǒng)揭示了lncRNA在六個連續(xù)發(fā)育的細(xì)胞群體中的時空表達(dá)、與鄰近蛋白編碼基因相關(guān)性、階段特異性基因等方面的表達(dá)特征,而且還通過與重要蛋白編碼基因的基因座共定位或共表達(dá)來預(yù)測相關(guān)lncRNA的生理功能。Pearson相關(guān)性分析顯示lncRNA與其鄰近的第一個蛋白編碼基因相關(guān)性最強(qiáng),主成分分析(Principal components analysis,PCA)表明lncRNA比mRNA更易于區(qū)別不同時空相似的細(xì)胞群體,揭示在造血干細(xì)胞發(fā)育過程中l(wèi)ncRNA可能具有更強(qiáng)的階段特異性,進(jìn)一步提示lncRNA在整個過程中發(fā)揮了重要作用。同時,針對研究分析出的401個全新的未注釋的lncRNA進(jìn)行了PCR和Sanger測序并鑒定出了一系列真實(shí)存在于HSC發(fā)育過程中全新未注釋的lncRNA分子,進(jìn)一步證實(shí)lncRNA調(diào)控HSC發(fā)育的潛在重要功能。后續(xù)按照三個嚴(yán)格的生物信息學(xué)分析篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選出10個潛在的功能性候選lncRNA,并通過體外集落培養(yǎng)功能實(shí)驗(Colony forming units in culture,CFU-C)發(fā)現(xiàn)6個可能在胚胎造血發(fā)育中發(fā)揮作用的lncRNA,這6個lncRNA分別是H19,AI66270,4933439C10Rik,Gm15135,Gm17275和1700113A16Rik。并進(jìn)一步利用條件性基因敲除的研究策略及AGM直接移植實(shí)驗,著重闡明了lncRNA-H19對于AGM區(qū)HSC發(fā)生至關(guān)重要,單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)lncRNA-H19缺失后重要造血轉(zhuǎn)錄因子Runx1和Spi1的表達(dá)顯著下調(diào),假時序分析也證明lncRNA-H19缺失后阻滯了內(nèi)皮向造血轉(zhuǎn)化這一階段。全基因組甲基化高通量測序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)lncRNA-H19的缺失使得重要造血轉(zhuǎn)錄因子(包括Runx1及Spi1等)的啟動子區(qū)域高甲基化,內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子如Sox17的啟動子區(qū)域低甲基化,提示lncRNA-H19可能通過調(diào)控重要造血轉(zhuǎn)錄因子和內(nèi)皮細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的甲基化水平來下調(diào)表達(dá)或上調(diào)表達(dá),以致血管內(nèi)皮細(xì)胞向pre-HSC的轉(zhuǎn)化受到阻滯。因為lncRNA所在位置決定了它們本身的功能,機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)胞漿定位的lncRNA-H19部分通過抑制甲基化調(diào)控分子S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase,SAHH)的活性來調(diào)控目的基因的甲基化水平。有趣的是,我們還發(fā)現(xiàn)lncRNA-H19這一作用是獨(dú)立于以往報道的lncRNA-H19作為microRNA前體(pri-miR)可能加工產(chǎn)生的產(chǎn)物mir-675而是其本身作用產(chǎn)生的。之前文獻(xiàn)報道m(xù)ir-675分子通過調(diào)控Igf1r-Igf2信號通路來維持成體HSC的靜息狀態(tài)。綜上所述,我們這一研究在國際上首次揭示了HSC發(fā)生過程中發(fā)揮重要功能的lncRNA,并系統(tǒng)闡述了lncRNA-H19在胚胎HSC發(fā)生與成體HSC穩(wěn)態(tài)維持中完全不同的功能以及調(diào)控方式。這些認(rèn)識將為全面理解lncRNA調(diào)控重要生物學(xué)過程的機(jī)制提供重要啟示,而且HSC發(fā)育全程的單細(xì)胞lncRNA圖譜也將為HSC發(fā)育和再生機(jī)制研究提供重要的數(shù)據(jù)庫和參考。
【學(xué)位單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

圖 2 造血干細(xì)胞發(fā)育中全新的未注釋 lncRNA 分析A 熱圖展示造血干細(xì)胞發(fā)生中階段特異性的未注釋 lncRNAB 之前報道的 BM HSC 特異性 lncHSC1 和 LncHSC2 在六個細(xì)胞群體中的C pre-HSC、FL HSC 和 BM HSC 三個群體中 lncRNA 與 Goodell 數(shù)據(jù)庫比析D lncRNA 與之前兩項報道的比較分析E PCR 和 Sanger 測序驗證未注釋的 lncRNAF 未注釋 lncRNA 驗證結(jié)果和表達(dá)情況近年一系列研究證實(shí) lncRNA 可通過調(diào)節(jié)鄰近蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄，精密

圖 3 從單細(xì)胞水平分析 lncRNA 與蛋白編碼基因的相關(guān)性A lncRNA 在基因間和基因內(nèi)的分布B lncRNA 與鄰近基因成對 Pearson 相關(guān)性分析C 反式作用中 lncRNA 與鄰近基因的相關(guān)性分析D 順式作用中 lncRNA 與鄰近基因的相關(guān)性分析E 根據(jù)與鄰近基因的基因位置關(guān)系順式中 lncRNA 的分類F 在所用細(xì)胞樣品中六種 lncRNA 分布G 六種 lncRNA-mRNA 對的相關(guān)性分析H 代表性 lncRNA-mRNA 正負(fù)相關(guān)表達(dá)I 不同物種間 lncRNA 保守性分析造血干細(xì)胞發(fā)育中 LncRNA 的階段性表達(dá)特征為了探索 HSC 發(fā)育過程中 lncRNA 的表達(dá)特征，我們首先在測序數(shù)據(jù)中挖9 個差異表達(dá)基因（圖 4 A），接著主成分分析顯示 128 個單細(xì)胞分成了獨(dú)個不同的細(xì)胞群體，并能明顯區(qū)分兩個相似相近的發(fā)育階段的細(xì)胞群體（

圖 4 HSC 發(fā)育中差異表達(dá) lncRNA 基因和特征性 lncRNA 基因A 差異表達(dá) lncRNA 基因的熱圖展示B lncRNAs 主成分分析C T1、T2 pre-HSC 和 E12 HSC、E14 HSC 四個細(xì)胞群體中差異表達(dá)lncRNAsD 基于 lncRNA 表達(dá)的 qPCR 結(jié)果的主成分分析.3 通過蛋白編碼基因的位置和表達(dá)相關(guān)性分析預(yù)測 LncRNA 功能由于在復(fù)雜的生理環(huán)境下生理過程中信號通路的激活或者相互作用而引起發(fā)生不同程度的表達(dá)，這樣細(xì)胞中的基因會形成獨(dú)特的基因表達(dá)模式，從而這個細(xì)胞群體或者生理過程的特征基因，這些特征基因被稱為名片基signature gene），名片基因可以揭示不同細(xì)胞群體的特征及功能，還具有預(yù)測。近年來成體骨髓中 HSC 的蛋白編碼基因方面的名片基因已被充分挖掘re-HSC 的蛋白編碼基因的名片基因也通過比較真正 pre-HSC 群體和陰性群體行分析研究。為了進(jìn)一步獲得與 HSC 潛能相關(guān)的特征性 lncRNA 基因，我們將造血干細(xì)

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本文編號：2824062