HIV-1感染會導(dǎo)致腸道固有層CD4+T淋巴細(xì)胞的大量損耗,引起腸道相關(guān)免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的異常、腸道上皮屏障損傷、微生物移位和持續(xù)的免疫激活。因此,HIV-1感染也被視為一種腸道疾病。增強(qiáng)腸道固有免疫以及在腸道部位建立特異的抗HIV-1免疫對HIV/AIDS防治具有重要意義。IL-22-IL-22RI和XCL1-XCRI是腸道粘膜免疫屏障維持和調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞因子通路。已有研究證明IL-22-IL-22R1通路在炎癥、抗病原菌感染和腸上皮組織維持和修復(fù)等方面具有重要作用,是粘膜系統(tǒng)重要的固有免疫分子,具有潛在的治療性調(diào)節(jié)作用。XCL1-XCR1不僅能調(diào)節(jié)腸道T淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)細(xì)胞組成,而且還在腸道內(nèi)抗原遞呈和維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)中起重要作用。不僅如此,XCL1也被認(rèn)為是有效的粘膜免疫佐劑。這些研究結(jié)論無疑都是在小鼠模型中得到的,而恒河猴作為人類疾病,特別是HIV-1研究不可替代的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,其IL-22-IL-22R1和XCL1-XCR1通路的生物學(xué)特性目前仍知之甚少。為更好的利用恒河猴研究IL-22通路分子在HIV-1感染過程中腸道粘膜相關(guān)損傷修復(fù)中的作用以及XCL1在HIV-1疫苗創(chuàng)制中的應(yīng)用前景。本研究做了以下幾點(diǎn)工作:1、為了解恒河猴IL-22及其受體IL-22R1的分子特性及功能,本研究采用RT-PCR和RACE擴(kuò)增方法首次克隆了 IL-22和IL-22R1cDNA核苷酸序列。IL-22 cDNA 全長 1163bp 包括 69bp-5'UTR,540bp-ORF 和 554bp-3'UTR。通過匹配基因組發(fā)現(xiàn)IL-22基因含有5個(gè)外顯子,位于恒河猴第11號染色體上,與IFN-γ和IL-26等基因形成IFN/IL-10相關(guān)細(xì)胞因子基因簇。IL-22R1 cDNA全長2802bp(32bp-5'UTR 1725bp-ORF和1045bp-3'UTR)。通過匹配基因組發(fā)現(xiàn)IL-22R1基因含有7個(gè)外顯子,位于第1號染色體上,而啟動(dòng)子分析顯示IL-22R1沒有保守的TATA啟動(dòng)元件,但在啟動(dòng)子上游序列分布著兩個(gè)CpG島。通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)恒河猴IL-22和IL-22R1與人IL-22和IL-22R1的氨基酸序列相似性分別為95.5%和96%。不僅如此,與IL-22結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的保守位點(diǎn)如半胱氨酸、糖基化位點(diǎn)以及配體-受體結(jié)合位點(diǎn)均與人 IL-22/IL-22R1 一致。2、運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法分析了IL-22 IL-22R1mRNA分子在正常恒河猴組織中的表達(dá)分布,發(fā)現(xiàn)IL-22和IL-22R1mRNA在腸道各部位均呈現(xiàn)高水平表達(dá),預(yù)示著IL-22-IL-22R1在腸道免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步研究恒河猴IL-22的腸道相關(guān)功能,并比較其與人IL-22的差異。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)并純化獲得了具有功能活性的重組恒河猴IL-22。通過體外刺激腸上皮細(xì)胞進(jìn)行功能性實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)表達(dá)的恒河猴IL-22與人IL-22均能激活下游信號分子STAT3發(fā)生Tyr705磷酸化,而對Ser727磷酸化無影響。而相比于人IL-22,恒河猴IL-22引發(fā)的STAT3 Tyr705磷酸化出現(xiàn)的峰值稍早。另外,恒河猴IL-22和人IL-22都能促進(jìn)上皮細(xì)胞多種抗菌肽的表達(dá),如BD-2,S100A8,S100A9,RegⅢα以及Muc1。不僅如此,恒河猴IL-22在低濃度下促進(jìn)細(xì)胞增殖,而在高濃度下卻顯示出抑制細(xì)胞增殖效應(yīng),而凋亡實(shí)驗(yàn)證明IL-22對腸上皮細(xì)胞的凋亡和抗凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)沒有明顯影響。3、為了解SIV/SHIV感染后IL-22及其相關(guān)分子的病理變化。本研究首先通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測SIV/SHIV感染前后腸道六個(gè)(十二指腸近端、空回腸近端、回腸、盲腸、結(jié)腸近端和直腸)組織部位中IL-22和IL-22R1 mRNA的表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸部位IL-22 mRNA存在顯著下調(diào),而其受體IL-22R1 mRNA的表達(dá)卻出現(xiàn)明顯上調(diào)。結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道,乙型結(jié)腸和結(jié)腸部位表達(dá)IL-22的細(xì)胞Th17、Th22以及ILC3s均發(fā)生大量的損耗,從而影響了 IL-22的表達(dá)。其受體IL-22R1呈現(xiàn)相反的變化趨勢,這其中的分子機(jī)制,以及上調(diào)表達(dá)的IL-22R1所產(chǎn)生的生理學(xué)效應(yīng)值得探究。4、為研究IL-22R1的上調(diào)表達(dá)的機(jī)制,以出現(xiàn)明顯表達(dá)變化的結(jié)腸部位做進(jìn)一步的研究。通過篩選多個(gè)炎癥因子的表達(dá),發(fā)現(xiàn)IL-1β呈現(xiàn)與IL-22R1同步上調(diào)表達(dá),并且具有顯著相關(guān)性。經(jīng)體外IL-1β刺激HT-29細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明IL-1β在轉(zhuǎn)錄水平上能顯著上調(diào)細(xì)胞IL-22R1的表達(dá),并且具有濃度依賴性。RNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明,IL-1β刺激細(xì)胞與不刺激組細(xì)胞內(nèi)IL-22R1具有幾乎一致的降解曲線。同樣通過Luciferase啟動(dòng)子報(bào)告實(shí)驗(yàn)也未能觀測出IL-1β單獨(dú)刺激對IL-22R1啟動(dòng)子活性的影響�；赟IV/SHIV感染后粘膜受損所產(chǎn)生的復(fù)雜的微環(huán)境,包括高水平的LPS、炎癥因子以及病毒蛋白分子等,本研究體外模擬LPS及Gp140等因子協(xié)同IL-1β刺激腸上皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)相比IL-1 β單獨(dú)刺激以及LPS+Gp 140共刺激組細(xì)胞,協(xié)同刺激組細(xì)胞IL-22R1的表達(dá)大幅度的上調(diào),而Luciferase啟動(dòng)子報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明,IL-22R1基因啟動(dòng)子在LPS、Gp140和IL-1β協(xié)同刺激下發(fā)生了明顯的激活。5、為進(jìn)一步探究SIV/SHIV感染后IL-22與其受體IL-22R1呈現(xiàn)相反的變化趨勢,其下游信號分子及相關(guān)抗菌肽表達(dá)變化。我們進(jìn)一步對IL-22主要信號分子STAT3的表達(dá)及磷酸化進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),無論是mRNA還是蛋白表達(dá)水平,感染后STAT3的表達(dá)均顯著性上調(diào)。不僅如此,STAT3在SIV/SHIV感染后出現(xiàn)更為明顯的Tyr705磷酸化。當(dāng)繼續(xù)篩選下游抗菌肽和粘蛋白分子的表達(dá)后發(fā)現(xiàn),粘蛋白Muc1與STAT3出現(xiàn)同步性的上調(diào)表達(dá)。與此同時(shí),為研究SIV/SHIV感染后上調(diào)表達(dá)的IL-22R1的生物學(xué)效應(yīng),本研究利用腺病毒包裝技術(shù)將IL-22R1基因?qū)氲侥c上皮細(xì)胞內(nèi),構(gòu)建體外過表達(dá)IL-22R1細(xì)胞模型。在等量的IL-22刺激后,過表達(dá)細(xì)胞會誘導(dǎo)更強(qiáng)的STAT3信號激活,而且相比腺病毒對照細(xì)胞,過表達(dá)IL-22R1細(xì)胞在繼續(xù)培養(yǎng)2d后即出現(xiàn)更為明顯的細(xì)胞增殖能力。6、為利用XCL1作為粘膜佐劑以及攜帶抗原靶向特異性CD8+DCs細(xì)胞,增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用,并探討其在HIV-1粘膜疫苗創(chuàng)制中的應(yīng)用。首先,本研究克隆獲得了恒河猴XCL1及其特異性受體XCR1 cDNA序列,分析并比較其與人XCL1和XCR1的分子高度相似。其次,擴(kuò)增XCL1 C端融合優(yōu)化的SIVmac239毒株V1V2模式抗原序列,并插入p1.0疫苗載體構(gòu)建真核表達(dá)p1.0-XCL1-linker-V1V2質(zhì)粒。同時(shí)還構(gòu)建單獨(dú)表達(dá)XCL1和V1V2以及結(jié)構(gòu)突變型質(zhì)粒LVC11A。通過流式細(xì)胞術(shù)和Western blot證實(shí)各疫苗質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后能表達(dá)相關(guān)蛋白。其次,為加強(qiáng)粘膜免疫應(yīng)答,本研究將四個(gè)疫苗質(zhì)粒用殼聚糖包裹形成納米微球,通過凝膠阻滯和包裹率分析證實(shí)疫苗質(zhì)粒均能有效的包裹在殼聚糖內(nèi)。透射電子顯微鏡觀測顯示包裹的殼聚糖-質(zhì)粒形成的微球大小均一(200-350nm)。通過DNaseI酶消化實(shí)驗(yàn)證實(shí)包裹后的納米微球能有效保護(hù)質(zhì)粒DNA的酶解。最后,將各殼聚糖-DNA包裹形成的納米微球通過鼻腔噴霧形式免疫恒河猴。三次免疫后相關(guān)抗體水平檢測結(jié)果顯示,血清中IgG和口腔中IgA產(chǎn)生較弱。而在腸道總IgA和特異性抗V1V2區(qū)IgA均顯著上調(diào),而且LV靶向質(zhì)粒免疫組相比單獨(dú)V1V2免疫組具有顯著差異。另外,通過XCL1攜帶V1V2結(jié)構(gòu)域的DNA鼻腔免疫也能引起更強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。綜上所述,本研究克隆獲得了恒河猴IL-22及其受體IL-22R1的序列,并比較其在序列特征、組織表達(dá)方面與人IL-22和IL-22R1的相似性。同時(shí)體外研究證明恒河猴IL-22具有活化腸上皮細(xì)胞STAT3信號分子、上調(diào)抗菌肽表達(dá)及增強(qiáng)細(xì)胞增殖等腸道相關(guān)功能,為利用恒河猴IL-22開展腸道疾病研究提供基礎(chǔ)。本研究全面分析了SIV/SHIV感染對腸道IL-22、IL-22R1、炎癥因子、及其下游信號分子和抗菌肽的表達(dá)影響,體外論證了 IL-1β在LPS和Gp140的協(xié)同作用下通過活化IL-22R1啟動(dòng)子活性上調(diào)IL-22R1的表達(dá)。而過表達(dá)的IL-22R1賦予細(xì)胞更強(qiáng)的信號活化和細(xì)胞增殖能力,為進(jìn)一步了解HIV-1感染后導(dǎo)致的腸道病理機(jī)制提供基礎(chǔ)。本研究利用XCL1作為粘膜佐劑的特性,以及攜帶V1V2模式抗原靶向特異性XCR1+DCs的特性,并結(jié)合納米包裹技術(shù)鼻腔免疫獲得明顯的腸道總IgA和特異性抗V1V2 IgA水平,為推進(jìn)HIV-1疫苗在增強(qiáng)粘膜免疫應(yīng)答方面提供借鑒。
【學(xué)位單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖１丨Ｌ－２２在腸道黏膜系統(tǒng)中的作用｜５］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＩＬ－２２邋ｉｎ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ邋ｍｕｃｏｓａｌ邋ｓｙｓｔｅｍ逡逑慢性ＨＩＶ－１感染導(dǎo)致乙型結(jié)腸產(chǎn)ＩＬ－２２邋Ｔ淋巴細(xì)胞和Ｔｈ２２細(xì)胞急劇下降，并伴逡逑隨明顯的腸道上皮細(xì)胞受損和微生物移位。相比未感染的ＣＤ４＋Ｔ細(xì)胞，循環(huán)Ｔｈ２２細(xì)逡逑胞高表達(dá)ＨＩＶ－１共受體ＣＣＲ５和整合素（Ｘ４Ｐ７邋（淋巴細(xì)胞向腸淋巴組織定向歸巢的特逡逑異性受體，可與ｇｐ－１２０蛋白結(jié)合分子）。因此，Ｔｈ２２細(xì)胞是ＨＩＶ－１更易感的細(xì)胞表逡逑型。體外腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)刺激實(shí)驗(yàn)表明，重組ＩＬ－２２蛋白能抵御ＨＩＶ－丨和ＴＮＦ－ａ誘導(dǎo)逡逑的腸上皮細(xì)胞損傷｜２２１。因此，重組ＩＬ－２２蛋白對ＨＩＶ感染后造成的腸粘膜損傷和繼逡逑發(fā)性細(xì)菌感染等方面的治療性作用值得期待。逡逑如上所述，ＩＬ－２２作為腸道固有免疫重要分子，并且在ＨＩＶ－１感染后粘膜修復(fù)和逡逑抗菌感染過程中具有潛在應(yīng)用前景。盡管有許多研究表明，在Ｈ１Ｖ－１感染或Ｓ１Ｖ／ＳＨＩＶ逡逑感染模型中產(chǎn)ＩＬ－２２的細(xì)胞急劇下降，包括Ｔｈ２２細(xì)胞、Ｔｈｌ７細(xì)胞、ＮＫｐ４４＋ＮＫ細(xì)胞逡逑和ｌＬＣ３ｓ細(xì)胞等，并伴隨腸上皮細(xì)胞的損傷和持續(xù)免疫激活１２３邋２４１。而對決定ＩＬ－２２功逡逑

中國疾病預(yù)防控制中心博士學(xué)位論文邐第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑通過匹配基因組序列發(fā)現(xiàn)，恒河猴／Ｉ－２２基因位于丨１號染色體的負(fù)鏈上，包含６逡逑個(gè)外顯子和５個(gè)內(nèi)含子。１Ｌ－２２基因與ＩＦＮ－ｙ、ＭＤＭ１和ＩＬ－２６相鄰，并形成一個(gè)逡逑ＩＬ－１０／ＩＦＮ相關(guān)細(xì)胞因子簇（圖１－２Ａ）。通過啟動(dòng)子序列預(yù)測發(fā)現(xiàn)，／Ｚ－２２基因含有兩逡逑個(gè)潛在的ＴＡＴＡｂｏｘ邋（位于ＴＳＳ上游的－３８２ｂｐ和－２２ｂｐ），由于－２２ｂｐ處的ＴＡＴＡ邋ｂｏｘ同逡逑時(shí)還是ＣＣＡＡＴ增強(qiáng)結(jié)合蛋白（Ｃ／ＥＢＰＰ）和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域（ＴＦＩＩＤ）結(jié)合位點(diǎn)，而逡逑更可能是真正的啟動(dòng)子。另外，也同樣預(yù)測到／Ｉ－２２基因啟動(dòng)子附近序列還存在其他逡逑的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如：ＦｏｘＰ３，ＹＹ１，邋ＮＦ－ＡＴ１和ＧＡＴＡ－１和３等（圖１－２Ｂ）。逡逑ＡｉＩＦＮＧ邐ｔ邐丨Ｌ－２６邐ｉ邋ＩＬ－２２ｋ邐ＭＤＭ１逡逑

２６１１邋ＣＴＴＣＡＧＡＣＡＡＡＴＧＡＡＴＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＡＡＣＣＴＣＧＧＴＴＴＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＡＣＡＴＧＧＧＧＡＴＣＡＴＡＡＣＡＣＣｒｒＡＣＣＴＣＡＴＧＧＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＡＡＧ逡逑２＾０１邋ＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＧ邋了邋Ｃ：ＡＴＧＴＣＴＴＴ／＾ＧＣＧＣｎ，ＴＡＡｉｍＴＧＣＣＴＧＡＴＡＣ＾ＣＣ；ＧＧＣＡＧＴＧＣＣＣ＾Ｔ／ｉＡ／ｊ：ＧＧＴＧＧＣｒＡＴＴＴ＾ｖＡＡＡ／＼ＡＡ，＾ＷｖＡ．逡逑圖１－５邋／Ｌ－２２Ｗ邋ｃＤＮＡ核苷酸序列及其推測的氨基酸序列逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－５邋Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ａｎｄ邋ｄｅｄｕｃｅｄ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ邋ｏｆ邋ｒｈｅｓｕｓ邋ｍａｃａｑｕｅ邋ＩＬ－２２Ｒ１邋ｃＤＮＡ逡逑Ｔｈｅ邋ｐｒｏｂａｂｌｅ邋ｓｉｇｎａｌ邋ｐｅｐｔｉｄｅ邋ｉｓ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｄ邋ｉｎ邋ｄａｒｋ邋ｇｒｅｙ．邋Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ｉｎｔｒｏｎｓ邋ａｒｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｄ邋ｂｙ逡逑ａｒｒｏｗｓ．邋Ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅ邋ｓｉｔｅｓ邋ａｒｅ邋ｄｏｕｂｌｅ邋ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ邋ａｎｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ逡逑ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ邋ｓｉｇｎａｌｓ邋（ＡＡＴＡＡＡ）邋ｉｓ邋ｂｏｘｅｄ．逡逑３９逡逑

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本文編號：2819575