目的:構(gòu)建表達(dá)細(xì)粒棘球絳蟲EgM123的重組恥垢分支桿菌,將該疫苗通過prime-boost免疫策略接種BALB/C小鼠,確定重組活載體疫苗是否可以延長(zhǎng)免疫周期,是否對(duì)基礎(chǔ)免疫起到增強(qiáng)的作用,及其誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫,為囊性包蟲病保護(hù)性疫苗的研究提供證據(jù)。方法:(1)擴(kuò)增EgM123蛋白編碼基因,將該基因片段插入到大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質(zhì)粒pMV261中,構(gòu)建pMV261-EgM123重組質(zhì)粒,用電穿孔的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌,構(gòu)建成rMS-EgM123重組疫苗。(2)經(jīng)過不斷的克隆過程觀察重組質(zhì)粒pMV261-EgM123在恥垢分枝桿菌中能否穩(wěn)定的存在。在rMS-EgM123的培養(yǎng)過程中,連續(xù)的檢測(cè)菌液的OD值,繪制出細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。(3)通過熱誘導(dǎo)的方法誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting鑒定表達(dá)的重組蛋白。(4)通過不同的免疫途徑和劑量接種BALB/C小鼠,通過不同的接種組合,用單次接種和加強(qiáng)免疫接種等方式接種BALB/C小鼠,分別在免疫后0周,2周,4周,5周,6周,7周,8周收集血清,并在第8周處死小鼠,分離小鼠腸粘膜,檢測(cè)血清和腸粘膜中IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA水平。(5)分離脾臟細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾CD4+和CD8+T細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的百分率。(6)用Q-PCR定量檢測(cè)脾臟中TNF-α,IFNγ,IL-4,IL-10,等因子的表達(dá)。(7)通過對(duì)各組小鼠小腸進(jìn)行組織染色,探究接種重組恥垢分枝桿菌疫苗后對(duì)小鼠腸黏膜免疫的影響。結(jié)果:(1)瓊脂糖凝膠電泳顯示EgM123(596bp)編碼基因擴(kuò)增成功,片段大小符合設(shè)計(jì)長(zhǎng)度。(2)重組質(zhì)粒pMV261-EgM123經(jīng)過PCR擴(kuò)增、雙酶切以及基因測(cè)序證明為正確表達(dá)閱讀框架。(3)我們含有重組質(zhì)粒rMS-EgM123的恥垢分枝桿菌連續(xù)克隆傳代10代后,測(cè)序結(jié)果表明在經(jīng)過10代傳代后重組質(zhì)粒pMV261-EgM123能在恥垢分枝桿菌沒有變異;rMS-EgM123的生長(zhǎng)曲線和恥垢分枝桿菌的生長(zhǎng)曲線保持一致。(4)SDS-PAGE顯示重組恥垢分枝桿菌rMS-EgM123表達(dá)量較低,沒有看到特別明顯的表達(dá)條帶,但Western blotting證實(shí)該蛋白能特異性的與抗EgM123血清起反應(yīng)。(5)通過不同的免疫策略接種小鼠,我們發(fā)現(xiàn),rMS-EgM123可以用于加強(qiáng)免疫,用rMS-EgM123加強(qiáng)免疫后,小鼠血清抗體呈現(xiàn)一個(gè)持續(xù)上升的趨勢(shì),而只有蛋白作為基礎(chǔ)免疫組(EgM123/PBS)小鼠抗體水平在經(jīng)過短暫的上升后就開始持續(xù)性的下降,單次免疫rMS-EgM123組小鼠血清中持續(xù)檢測(cè)出較低水平的抗EgM123抗體,而接種了空載恥垢分枝桿菌MS的小鼠血清中檢測(cè)不到特異抗體。(6)抗體亞類的檢測(cè)顯示,加強(qiáng)免疫組(EgM123/rMS)和蛋白基礎(chǔ)免疫未加強(qiáng)組(EgM123/PBS)小鼠血清中主要以IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3為主,沒有檢測(cè)到IgA的生成;加強(qiáng)免疫組IgG2b抗體水平要高于未加強(qiáng)免疫組,其余亞類兩者之間沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而單次免疫rMS-EgM123(rMS)則產(chǎn)生了較弱的IgG1和IgG2b。在腸粘膜中,加強(qiáng)免疫組(EgM123/rMS)產(chǎn)生了較高水平的IgG1、IgG2a和IgG2b;而未加強(qiáng)免疫組(EgM123)產(chǎn)生了較高水平的IgG2a和IgG2b;有趣的是,rMS-EgM123組則產(chǎn)生了IgA。(7)免疫接種后,小鼠脾臟B細(xì)胞所占的比率要高于正常組,而T淋巴細(xì)胞和T細(xì)胞亞群的百分含量均無差異。單獨(dú)免疫了rMS和MS組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中,B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞所占脾臟淋巴細(xì)胞比值低于正常組小鼠,而在T細(xì)胞亞群分類中,這兩組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞在免疫后高于正常組,兩組小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞則要低于正常組。(8)小鼠小腸組織HE染色可以看出,EgM123/rMS組小腸絨毛膜呈現(xiàn)出不同程度的鋸齒狀,絨毛膜周圍有較多的細(xì)胞侵潤。(9)用不同策略免疫后小鼠脾臟Th1和Th2細(xì)胞因子表達(dá)沒有明顯的改變。結(jié)論:重組恥垢分枝桿菌rMS-EgM123能在體內(nèi)外表達(dá)EgM123抗原蛋白,且能作為BOOST疫苗加強(qiáng)基礎(chǔ)免疫刺激機(jī)體產(chǎn)生的體液免疫,也能在一定程度上增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫水平,對(duì)小腸粘膜保護(hù)性免疫也有一定的作用。可以將rMS作為抗包蟲病的候選疫苗。
【學(xué)位單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R383.33
【部分圖文】：

圖 1-1 重組 rMS-EgM123 構(gòu)建示意圖Fig 1-1 The schematic diagram of the constraction of rMS-EgM123引物設(shè)計(jì) Genebank 公布的 EgM123 基因序列（AAL96201.1）設(shè)計(jì)引物并加coRⅠ和 SalⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)。如下：引物 5’-- CATGAATTCATGGAACCAGTGAATTTTGCC--3’；引物 5’-- ACTGTCGACTTATTTCGTCTTTAAGGCACGAAAC--3’。海生工合成。ET28a-EgM123 模板質(zhì)粒的提取

圖 1-2. EgM123 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物M:DL2000 分子標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量；1：EgM123 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig 1-2 PCR product of EgM123 geneLanes:1. DL2000 Marker; 1: EgM123 PCR product達(dá)載體 pMV261-EgM123 的克隆鑒定定：構(gòu)建好的重組質(zhì)粒 pMV261-EgM123 經(jīng)過1％瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒 pMV26bp，與目的基因 PCR 產(chǎn)物大小一致，進(jìn)一步證

圖 1-2. EgM123 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物M:DL2000 分子標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量；1：EgM123 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig 1-2 PCR product of EgM123 geneLanes:1. DL2000 Marker; 1: EgM123 PCR products穿梭表達(dá)載體 pMV261-EgM123 的克隆鑒定粒 PCR 鑒定：構(gòu)建好的重組質(zhì)粒 pMV261-EgM123 經(jīng)過 PC產(chǎn)物以 1％瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒 pMV261-為 594bp，與目的基因 PCR 產(chǎn)物大小一致，進(jìn)一步證實(shí)圖 1-3

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 何子純;李升錦;;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)重組恥垢分枝桿菌的活力研究[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2011年08期

2 吳雯;張紅宇;黃漢菊;范興;羅道泉;吳少庭;;重組恥垢分枝桿菌Msmc~2-CFP10-ESAT6的構(gòu)建[J];中國病原生物學(xué)雜志;2009年03期

3 徐永柱;呂琳;;恥垢分枝桿菌疫苗經(jīng)灌胃免疫在小鼠體內(nèi)的分布與安全性研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年09期

4 楊春;王渝偉;伊正君;何永林;李娜;徐蕾;張黎;朱道銀;;顆粒溶素和白細(xì)胞介素12重組恥垢分枝桿菌對(duì)小鼠結(jié)核病的治療作用[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2007年02期

5 李仲興;;恥垢分枝桿菌群感染及其菌種鑒定[J];中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2006年05期

6 徐苗,陳保文,沈小兵,蘇城,羅永艾,王國治;恥垢分枝桿菌作為免疫調(diào)節(jié)劑的研究[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2005年09期

7 胡亞文;白嘉誠;葛文雪;姚夢(mèng)依;張雪蓮;;恥垢分枝桿菌中反式翻譯報(bào)告體系的構(gòu)建[J];微生物與感染;2019年01期

8 姚建忠,許崇波,劉齊貴,靳風(fēng)爍;表達(dá)人白細(xì)胞介素-2重組恥垢分枝桿菌疫苗株的建立[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年07期

9 楊春;徐蕾;伊正君;何永林;李娜;王渝偉;張黎;朱道銀;;重組恥垢分枝桿菌對(duì)小鼠結(jié)核病免疫治療效果的評(píng)價(jià)[J];免疫學(xué)雜志;2007年04期

10 程繼忠,鄭波,肖紅梁,駒卿,皇甫永穆;結(jié)核桿菌HSP70在恥垢分枝桿菌中的表達(dá)及其免疫原性研究[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1998年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 甘燕;吳少庭;劉洪波;李俊華;黃達(dá)娜;余新炳;;表達(dá)SARS病毒M蛋白重組恥垢分枝桿菌疫苗株的建立及其免疫原性分析[A];全國寄生蟲學(xué)與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2006年

2 陳凌;;重組恥垢分枝桿菌rMS-Ag85a-IL-17a對(duì)非特異性哮喘小鼠氣道炎癥的影響及作用機(jī)制[A];第十三屆江浙滬兒科學(xué)術(shù)會(huì)議暨2016年浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2016年

3 賈平平;岑山;;異煙肼耐藥恥垢分枝桿菌的建立及藥物敏感性的測(cè)定[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2010年

4 楊春;王渝偉;伊正君;何永林;李娜;徐蕾;朱道銀;;GLS／IL-12重組恥垢分枝桿菌對(duì)小鼠結(jié)核病治療作用的實(shí)驗(yàn)研究[A];2006中國微生物學(xué)會(huì)第九次全國會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2006年

5 張震;龍泉鑫;黃謙;謝建平;;恥垢分枝桿菌對(duì)TM4噬菌體耐受的機(jī)制研究[A];2012年第五屆全國微生物遺傳學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2012年

6 張旭霞;車南穎;李傳友;;恥垢分枝桿菌esx-3基因敲除與esat-6/cfp10基因回補(bǔ)[A];《中國防癆雜志》創(chuàng)刊80周年紀(jì)念暨學(xué)術(shù)會(huì)議資料匯編[C];2014年

7 黃海榮;Michael McNeil;;結(jié)核分枝桿菌基因Rv3806c以及恥垢分枝桿菌mc2155和棒狀分枝桿菌中Rv3806c同源基因的功能分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)2006年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

8 何萍;楊楊;宋厚輝;;牛分枝桿菌PE12蛋白在分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞中作用機(jī)制的初步研究[A];中國獸醫(yī)病理學(xué)2017年學(xué)術(shù)研討會(huì)暨獸醫(yī)病理學(xué)分會(huì)第九次全國會(huì)員代表大會(huì)論文集[C];2017年

9 郭建;范齊文;范小勇;馬輝;錢雪琴;胡香南;吳文娟;;結(jié)核分枝桿菌rdESAT-6抗原在恥垢分枝桿菌中的制備及其血清學(xué)診斷研究[A];第四屆中國臨床微生物學(xué)大會(huì)暨微生物學(xué)與免疫學(xué)論壇論文匯編[C];2013年

10 李俊明;;結(jié)核分枝桿菌異檸檬酸裂合酶對(duì)分枝桿菌胞內(nèi)存活的影響及其相關(guān)機(jī)制研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議資料匯編[C];2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 黃鳳;結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

2 李啟明;結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的鑒定及耐藥分子機(jī)理的研究[D];西南大學(xué);2018年

3 肖婧;CRISPR干擾系統(tǒng)的建立及其在分枝桿菌重要基因功能研究中的應(yīng)用[D];北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所;2018年

4 史麗濱;恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis）EmbC蛋白C端的功能探討[D];大連醫(yī)科大學(xué);2005年

5 伊正君;靶向遞送GLS/IL-12真核共表達(dá)質(zhì)粒的重組恥垢分枝桿菌治療性活疫苗的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2006年

6 向廷秀;幽門螺桿菌重組恥垢分枝桿菌疫苗的構(gòu)建及作用機(jī)理研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2006年

7 楊春;GLS/IL-12重組恥垢分枝桿菌對(duì)小鼠結(jié)核病的治療作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2007年

8 商正玲;結(jié)核Rv1246c-Rv1247c基因重組恥垢分枝桿菌及其編碼蛋白功能的初步研究[D];四川大學(xué);2007年

9 劉慧聰;兩個(gè)TetR家族的轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)恥垢分枝桿菌藥物抗性調(diào)控的分子機(jī)制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

10 曹俊;結(jié)核分枝桿菌脂肪酶的功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 何黎;細(xì)粒棘球絳蟲EgM123重組恥垢分枝桿菌構(gòu)建及其免疫原性研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2019年

2 常芳倩;恥垢分枝桿菌整合宿主因子MsIHF的結(jié)構(gòu)與功能研究[D];安徽大學(xué);2019年

3 梁思佳;腸道病毒71型疫苗的交叉保護(hù)作用及其基因重組恥垢分枝桿菌疫苗的構(gòu)建[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2018年

4 郭殊瑾;恥垢分枝桿菌mc~2155中rpfA基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

5 梁大航;基于弓形蟲ROP18的重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建及鑒定[D];蚌埠醫(yī)學(xué)院;2013年

6 鄭慧敏;低頻低強(qiáng)度超聲介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌及恥垢分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2017年

7 曹俊;恥垢分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌抗原的交叉免疫反應(yīng)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2017年

8 趙善民;重組恥垢分枝桿菌在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答、保護(hù)力及對(duì)感染小鼠的免疫治療作用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2012年

9 周思;恥垢分枝桿菌中一個(gè)新型c-di-GMP響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子及其調(diào)控功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

10 劉雪梅;恥垢分枝桿菌突變菌株庫的建立及耐卷曲霉素突變株的篩選與性質(zhì)研究[D];西南大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2816714