目的:構(gòu)建表達細粒棘球絳蟲EgM123的重組恥垢分支桿菌,將該疫苗通過prime-boost免疫策略接種BALB/C小鼠,確定重組活載體疫苗是否可以延長免疫周期,是否對基礎免疫起到增強的作用,及其誘導的體液免疫和細胞免疫,為囊性包蟲病保護性疫苗的研究提供證據(jù)。方法:(1)擴增EgM123蛋白編碼基因,將該基因片段插入到大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質(zhì)粒pMV261中,構(gòu)建pMV261-EgM123重組質(zhì)粒,用電穿孔的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌,構(gòu)建成rMS-EgM123重組疫苗。(2)經(jīng)過不斷的克隆過程觀察重組質(zhì)粒pMV261-EgM123在恥垢分枝桿菌中能否穩(wěn)定的存在。在rMS-EgM123的培養(yǎng)過程中,連續(xù)的檢測菌液的OD值,繪制出細菌的生長曲線。(3)通過熱誘導的方法誘導目的蛋白表達,經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting鑒定表達的重組蛋白。(4)通過不同的免疫途徑和劑量接種BALB/C小鼠,通過不同的接種組合,用單次接種和加強免疫接種等方式接種BALB/C小鼠,分別在免疫后0周,2周,4周,5周,6周,7周,8周收集血清,并在第8周處死小鼠,分離小鼠腸粘膜,檢測血清和腸粘膜中IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA水平。(5)分離脾臟細胞用流式細胞儀檢測脾CD4+和CD8+T細胞和B淋巴細胞的百分率。(6)用Q-PCR定量檢測脾臟中TNF-α,IFNγ,IL-4,IL-10,等因子的表達。(7)通過對各組小鼠小腸進行組織染色,探究接種重組恥垢分枝桿菌疫苗后對小鼠腸黏膜免疫的影響。結(jié)果:(1)瓊脂糖凝膠電泳顯示EgM123(596bp)編碼基因擴增成功,片段大小符合設計長度。(2)重組質(zhì)粒pMV261-EgM123經(jīng)過PCR擴增、雙酶切以及基因測序證明為正確表達閱讀框架。(3)我們含有重組質(zhì)粒rMS-EgM123的恥垢分枝桿菌連續(xù)克隆傳代10代后,測序結(jié)果表明在經(jīng)過10代傳代后重組質(zhì)粒pMV261-EgM123能在恥垢分枝桿菌沒有變異;rMS-EgM123的生長曲線和恥垢分枝桿菌的生長曲線保持一致。(4)SDS-PAGE顯示重組恥垢分枝桿菌rMS-EgM123表達量較低,沒有看到特別明顯的表達條帶,但Western blotting證實該蛋白能特異性的與抗EgM123血清起反應。(5)通過不同的免疫策略接種小鼠,我們發(fā)現(xiàn),rMS-EgM123可以用于加強免疫,用rMS-EgM123加強免疫后,小鼠血清抗體呈現(xiàn)一個持續(xù)上升的趨勢,而只有蛋白作為基礎免疫組(EgM123/PBS)小鼠抗體水平在經(jīng)過短暫的上升后就開始持續(xù)性的下降,單次免疫rMS-EgM123組小鼠血清中持續(xù)檢測出較低水平的抗EgM123抗體,而接種了空載恥垢分枝桿菌MS的小鼠血清中檢測不到特異抗體。(6)抗體亞類的檢測顯示,加強免疫組(EgM123/rMS)和蛋白基礎免疫未加強組(EgM123/PBS)小鼠血清中主要以IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3為主,沒有檢測到IgA的生成;加強免疫組IgG2b抗體水平要高于未加強免疫組,其余亞類兩者之間沒有明顯的統(tǒng)計學差異;而單次免疫rMS-EgM123(rMS)則產(chǎn)生了較弱的IgG1和IgG2b。在腸粘膜中,加強免疫組(EgM123/rMS)產(chǎn)生了較高水平的IgG1、IgG2a和IgG2b;而未加強免疫組(EgM123)產(chǎn)生了較高水平的IgG2a和IgG2b;有趣的是,rMS-EgM123組則產(chǎn)生了IgA。(7)免疫接種后,小鼠脾臟B細胞所占的比率要高于正常組,而T淋巴細胞和T細胞亞群的百分含量均無差異。單獨免疫了rMS和MS組小鼠脾臟淋巴細胞中,B淋巴細胞和T淋巴細胞所占脾臟淋巴細胞比值低于正常組小鼠,而在T細胞亞群分類中,這兩組小鼠脾臟CD4+T細胞在免疫后高于正常組,兩組小鼠脾臟CD8+T細胞則要低于正常組。(8)小鼠小腸組織HE染色可以看出,EgM123/rMS組小腸絨毛膜呈現(xiàn)出不同程度的鋸齒狀,絨毛膜周圍有較多的細胞侵潤。(9)用不同策略免疫后小鼠脾臟Th1和Th2細胞因子表達沒有明顯的改變。結(jié)論:重組恥垢分枝桿菌rMS-EgM123能在體內(nèi)外表達EgM123抗原蛋白,且能作為BOOST疫苗加強基礎免疫刺激機體產(chǎn)生的體液免疫,也能在一定程度上增強機體細胞免疫水平,對小腸粘膜保護性免疫也有一定的作用�？梢詫MS作為抗包蟲病的候選疫苗。
【學位單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R383.33
【部分圖文】：

圖 1-1 重組 rMS-EgM123 構(gòu)建示意圖Fig 1-1 The schematic diagram of the constraction of rMS-EgM123引物設計 Genebank 公布的 EgM123 基因序列（AAL96201.1）設計引物并加coRⅠ和 SalⅠ兩個酶切位點。如下：引物 5’-- CATGAATTCATGGAACCAGTGAATTTTGCC--3’；引物 5’-- ACTGTCGACTTATTTCGTCTTTAAGGCACGAAAC--3’。海生工合成。ET28a-EgM123 模板質(zhì)粒的提取

圖 1-2. EgM123 基因 PCR 擴增產(chǎn)物M:DL2000 分子標準質(zhì)量；1：EgM123 擴增產(chǎn)物Fig 1-2 PCR product of EgM123 geneLanes:1. DL2000 Marker; 1: EgM123 PCR product達載體 pMV261-EgM123 的克隆鑒定定：構(gòu)建好的重組質(zhì)粒 pMV261-EgM123 經(jīng)過1％瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒 pMV26bp，與目的基因 PCR 產(chǎn)物大小一致，進一步證

圖 1-2. EgM123 基因 PCR 擴增產(chǎn)物M:DL2000 分子標準質(zhì)量；1：EgM123 擴增產(chǎn)物Fig 1-2 PCR product of EgM123 geneLanes:1. DL2000 Marker; 1: EgM123 PCR products穿梭表達載體 pMV261-EgM123 的克隆鑒定粒 PCR 鑒定：構(gòu)建好的重組質(zhì)粒 pMV261-EgM123 經(jīng)過 PC產(chǎn)物以 1％瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒 pMV261-為 594bp，與目的基因 PCR 產(chǎn)物大小一致，進一步證實圖 1-3

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