發(fā)布時間：2020-09-11 08:13

　　 研究背景和目的:紅系發(fā)育是指造血干細(xì)胞在造血微環(huán)境中分化為成熟紅細(xì)胞的全過程。這一過程大致可分為紅系發(fā)育早期階段、紅系發(fā)育終末階段和網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟三個階段,并伴隨著一系列獨(dú)特的變化,包括細(xì)胞體積的減小、血紅蛋白合成增加、染色質(zhì)固縮以及脫核等。因此,紅系發(fā)育需要精細(xì)而復(fù)雜的調(diào)控。既往對紅系發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制研究主要集中在促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin,EPO)及其受體(Erythropoietin receptor,EPOR)、糖皮質(zhì)激素及其受體、轉(zhuǎn)錄因子GATA1、GATA2及KLF1等和表觀遺傳修飾如小RNA(microRNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)、DNA甲基化以及乙�；揎椀确矫�。但關(guān)于激酶在這一調(diào)控過程的研究仍較少。PIM2(Proviral Integrations of Moloney virus 2)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要的抗凋亡和促進(jìn)增殖的作用,而其在人紅系發(fā)育中的作用尚不明確。為了研究其功能,我們利用shRNA敲低技術(shù)在人CD34~+造血干細(xì)胞階段敲低PIM2的表達(dá)并定向紅系分化,檢測其在紅系分化過程中的作用。同時,為了觀察PIM2在K562、HEL和TF1這三種血液惡性腫瘤細(xì)胞系中的功能,我們利用相同的方法敲低PIM2的表達(dá),并利用Hemin誘導(dǎo)其向紅系分化,檢測在此過程中PIM2對血液惡性腫瘤細(xì)胞系向紅系分化進(jìn)程的影響。課題的完成將有助于闡釋PIM2在正常生理及疾病過程中的作用及潛在的分子機(jī)制。研究方法:利用RNA-seq分析PIM2在胎肝來源、外周血來源及臍帶血來源的CD34~+細(xì)胞定向分化的紅系各期細(xì)胞的表達(dá)譜,并利用qRT-PCR和Western Blot的方法驗證PIM2在臍帶血CD34~+細(xì)胞定向分化的紅系細(xì)胞中的表達(dá);利用臍帶血CD34~+造血干細(xì)胞培養(yǎng)巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等,利用qRT-PCR檢測PIM2的表達(dá)。為了研究PIM2在紅系發(fā)育過程中的作用,我們設(shè)計了可敲低PIM2表達(dá)的shRNA,在臍帶血CD34~+造血干細(xì)胞階段敲低PIM2的表達(dá),定向紅系分化;利用qRT-PCR和Western Blot檢測敲低效率,流式細(xì)胞術(shù)檢測紅系早期分化、終末分化、增殖、周期、凋亡以及脫核等;細(xì)胞計數(shù)檢測紅系細(xì)胞的增殖、Cytospins觀察不同培養(yǎng)天數(shù)的紅系細(xì)胞形態(tài)的改變。在檢測的過程中細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象,進(jìn)一步利用AO-EB染色確認(rèn)細(xì)胞凋亡。根據(jù)PIM2敲低后凋亡明顯增加的表型我們運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測P53的蛋白表達(dá)水平以及qRT-PCR檢測P53下游基因BAX和P21等的表達(dá)以及調(diào)控P53蛋白穩(wěn)定性的MDM2的表達(dá)。Western Blot驗證P53及其下游P21和BAX的表達(dá)。利用相同的方法,在K562、HEL和TF1這三種血液惡性腫瘤細(xì)胞系中敲低PIM2的表達(dá)。利用流式細(xì)胞術(shù)、聯(lián)苯胺染色等方法,探究PIM2敲低對這三種細(xì)胞系的增殖、分化以及凋亡的影響。結(jié)果和結(jié)論:RNA-seq結(jié)果顯示PIM2在胎肝來源、外周血來源以及臍帶血來源的CD34~+造血干細(xì)胞定向紅系分化的各期細(xì)胞中的表達(dá)均是逐漸升高,在Ortho-E期的表達(dá)均是最高的。qRT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示PIM2的mRNA和蛋白水平在臍帶血CD34~+造血干細(xì)胞來源的紅系細(xì)胞分化中表達(dá)逐漸升高。qRT-PCR結(jié)果顯示Ortho-E期PIM2的表達(dá)均高于常見的血液系統(tǒng)細(xì)胞和其他常見人類細(xì)胞。細(xì)胞計數(shù)和流式結(jié)果顯示PIM2敲低不影響早期紅系分化和增殖,顯著延遲終末紅系分化。與對照組相比,敲低組終末紅系細(xì)胞的數(shù)目降低超過2倍,G0/G1期升高了約15%,敲低組的S期與正常組比較降低了約10%,凋亡細(xì)胞比例增加超過2.5倍。此外,PIM2敲低還導(dǎo)致紅系細(xì)胞的脫核比例明顯下降。利用流式細(xì)胞術(shù)我們發(fā)現(xiàn)P53的蛋白表達(dá)升高超過2倍。進(jìn)一步利用qRT-PCR檢測P53的mRNA表達(dá)以及其下游基因BAX、P21、BAK和NOXA的表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)PIM2敲低導(dǎo)致P53下游基因表達(dá)水平均增加3倍以上,但不影響P53 mRNA的表達(dá)。Western Blot結(jié)果進(jìn)一步顯示PIM2敲低后導(dǎo)致P53及其下游P21和BAX的表達(dá)明顯升高。MDM2可以降解P53蛋白,進(jìn)一步我們利用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)MDM2的表達(dá)下降超過50%。PIM2敲低對K562細(xì)胞增殖、分化以及凋亡無明顯影響。對HEL細(xì)胞分化有抑制、對細(xì)胞的凋亡和增殖無影響。對TF1細(xì)胞的增殖和凋亡無影響但促進(jìn)了細(xì)胞的分化。PIM2敲低在正常紅系發(fā)育中具有階段性調(diào)控作用,對早期紅系細(xì)胞增殖以及分化無明顯影響,對終末紅系細(xì)胞增殖、分化和脫核起到重要的調(diào)控作用;其中PIM2敲低導(dǎo)致終末紅系細(xì)胞凋亡的主要原因可能是激活了P53介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡信號通路;與此同時PIM2敲低對惡性血液腫瘤細(xì)胞系向紅系分化時細(xì)胞增殖和凋亡無明顯影響。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

不但能夠維持紅細(xì)胞獨(dú)特的雙面凹陷的圓盤形狀，使其能夠以最大限度地從周圍的環(huán)境中攝取足夠的氧氣的功能，而且賦予了紅細(xì)胞強(qiáng)大的柔韌性和變形能力，這些均為紅細(xì)胞行使運(yùn)輸氧氣提供了強(qiáng)大的生理功能保障。與此同時，紅細(xì)胞中含有大量豐富的血紅蛋白，這種紅細(xì)胞特有的蛋白能夠結(jié)合在肺部與氧結(jié)合形成氧合血紅蛋白，是紅細(xì)胞能夠攜帶氧氣的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[3,4]。紅細(xì)胞的生成是個復(fù)雜的過程，經(jīng)歷了多能干細(xì)胞向紅系分化和紅系祖細(xì)胞的繼續(xù)分化直至發(fā)育成熟等過程。紅系發(fā)育是造血發(fā)育的重要分支，主要可分成三個階段：1、早期發(fā)育階段：主要指從造血干細(xì)胞發(fā)育生成 BFU-E 和 CFU-E的階段；2、終末分化階段：主要是指從形態(tài)上可分辨的原始紅細(xì)胞經(jīng)過早幼紅細(xì)胞、中幼紅細(xì)胞和晚幼紅細(xì)胞，進(jìn)而脫核生成網(wǎng)織紅細(xì)胞的過程；3、網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟階段：網(wǎng)織紅細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)逐漸成熟[5]。其中早幼紅細(xì)胞階段便可產(chǎn)生具有攜氧功能的血紅蛋白，而晚幼紅細(xì)胞階段主要發(fā)生的事件是細(xì)胞核的脫出。血紅蛋白的生成以及細(xì)胞核的排出是紅細(xì)胞分化并逐漸走向成熟的重要標(biāo)志，見圖 1.1。

圖 1.2 PIM 蛋白亞型示意圖（引自：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/med.21284）人的 PIMs 激酶也是彼此高度同源：在氨基酸水平上，PIM2 和 PIM1 53%是相同的，而 PIM2 和 PIM3 有 65%的同源性，三個 PIM 激酶的一些功能冗余在體外[10,11]和體內(nèi)[12,13]已被證明。已經(jīng)有報道稱 PIM1 和 PIM2 的翻譯起始位點(diǎn)不同，產(chǎn)生了具有不同分子量的亞型。PIM1 激酶編碼 34kDa 和 44kDa 同種型，但這兩種型的激酶活性是相同的。PIM2 以三種同種型(34kDa、37kDa 和 40kDa)存在，但是對它們?nèi)齻�蛋白質(zhì)功能或相互作用的差異并沒有很多的解釋和討論。PIM3僅為單一的同種型。PIM 激酶亞型普遍表達(dá)，但具有一些組織特異性：PIM1 在造血細(xì)胞、胃、頭頸部和前列腺腫瘤中有高表達(dá)。PIM2 在淋巴和腦組織中表達(dá)很高；PIM3 在乳腺癌、腎癌和腦組織中高表達(dá)。1.2.2 PIM2 調(diào)節(jié)的信號通路PIM 激酶的表達(dá)不僅受到不同類型的調(diào)控因子所控制，而且還受到轉(zhuǎn)錄水

圖 1.3 PIM 蛋白激酶激活模式圖（引自：https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0006-2952(12)00649-1）PIM2 基因是作為莫洛尼小鼠白血病病毒的前整合位點(diǎn)最早被發(fā)現(xiàn)的。小鼠的 PIM2 基因首先被我們克隆出來，接著人、青蛙、牛、老鼠以及斑馬PIM2 基因也被逐一的克隆出來[15,16]。根據(jù) PIM2 基因的特性，PIM2 編碼的是一種高度保守的絲/蘇氨酸激酶，PIM2 基因的表達(dá)水平不僅僅是受到激素胞因子和分裂素等這些非自身條件的影響，同時也受到其自身轉(zhuǎn)錄水平的錄后水平的、翻譯水平的以及翻譯后水平的自身因素的影響，就目前以上表明 PIM2 蛋白和大部分的細(xì)胞功能如其凋亡、增殖、分化和腫瘤發(fā)生以及發(fā)展均是緊密關(guān)聯(lián)的[17]。隨著人們對腫瘤發(fā)病學(xué)不斷深入的研究，絲/蘇氨酶 PIM2 在如何抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制這方面得到有越來越多的關(guān)注。通較與不同癌基因作用和 PIM2 的作用機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)，PIM2 具有強(qiáng)大而廣抗凋亡作用，雖然目前僅僅對 PIM2 作用的機(jī)制作了初步的判斷，但仍可以后 PIM2 的研究提供一些思路。

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