人口老齡化會面臨各種退行性疾病的高發(fā)。其中,神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病占有很大的比例。本課題主要圍繞帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的細胞療法展開研究,為之后研究中腦DA神經(jīng)元的發(fā)育路徑,PD發(fā)病機制和開展PD的細胞療法奠定了堅實的基礎。PD的發(fā)病機制主要是中腦黑質(substantia nigra pars compacta,SNc)區(qū)域DA神經(jīng)元的死亡導致多巴胺(dopamine,DA)分泌量減少。開展PD的細胞治療,最重要的是要得到源源不斷的供體細胞,即DA神經(jīng)前體細胞。本課題主要研究目標是建立DA神經(jīng)元的分化體系,為PD的細胞療法提供細胞。采用的策略是將人胚胎干細胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)定向分化為DA前體細胞從而得到供體細胞。首先,通過添加特定組合的因子將hESCs誘導分化為神經(jīng)底板細胞(neural floor plate cells,NFP),這部分細胞能夠表達神經(jīng)底板細胞的標志物LMX1A,FOXA2,OTX2。然后,經(jīng)過FGF8等因子的誘導,神經(jīng)底板細胞能夠分化為DA前體細胞,這些細胞能夠表達中腦的標志物LMX1A,FOXA2,EN1。我們將其體外培養(yǎng)發(fā)成熟為多巴胺神經(jīng)元后,它能夠表達成熟DA神經(jīng)元的標志物TH,TUJ1。為了探究不同hESCs的分化潛力是否存在差異,我們采用了12株hESCs進行了DA的分化。實驗結果證明,不同hESCs分化產(chǎn)生的DA神經(jīng)前體細胞的效率是不同的,并篩選出了一株DA分化潛力較高hESCs,為DA的分化提供種子細胞。目前建立的DA神經(jīng)元的化體系仍有不足之處。第一個不足之處是:DA前體細胞的標志物LMX1A的表達比例過低。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)LMX1A在發(fā)育上是由WNT通路調控的,而CHIR99021是WNT通路的激活劑,所以我們利用了H9-LMX1A的報告細胞系對CHIR99021的最適濃度進行了篩選,進而上調LMX1A的表達水平。第二個不足之處是試劑不符合臨床要求。由于基礎級B27中含有BSA成分,我們更換為臨床級B27。實驗結果證明臨床級B27可以較好的取代基礎級B27。第三個不足之處是DA神經(jīng)元的分化效率較低。本課題使用兩種方法來提高DA神經(jīng)元的分化效率。一種提高效率的方法是通過延長兩種營養(yǎng)因子GDNF和TGFβ3的作用時間來為DA神經(jīng)元提供分化所需的營養(yǎng)物質,進而提高LMX1A,FOXA2,EN1,TH,TUJ1的表達比例。另一種方法是在ES細胞誘導分化為神經(jīng)細胞的過程中,通過降低高SHH的濃度,同時加入SHH的激活劑PP來增強腹側化程度來提高DA神經(jīng)元的分化效率。從分化成本上看,SHH是一種蛋白質,價格較貴,這樣也可以減少DA神經(jīng)元的分化的成本,這為后續(xù)大量提供DA細胞治療PD提供了很大的幫助。綜上所述,本課題主要包括三個部分:DA神經(jīng)元分化體系的建立,不同hESCs向DA分化潛力的差異性研究,DA神經(jīng)元分化體系的優(yōu)化。這不僅為PD的細胞治療提供了充足的供體細胞,還為DA分化體系的優(yōu)化提供了寶貴經(jīng)驗。
【學位單位】：曲阜師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生退行性病變的一類疾患者會出現(xiàn)身體震顫、肌肉僵直、身體姿勢不能保持平衡等的運動癥狀和嗅覺發(fā)生便秘、睡眠行為和精神方面異常等的非運動方面的癥狀，嚴重影響了患者的工作和生1.2 發(fā)病機制多巴胺神經(jīng)元主要分布于嗅球到中腦的區(qū)域（圖 1.1）。中腦區(qū)域的多巴胺神經(jīng)元有三群，分別位于紅核后區(qū)（A8），黑質致密部（substantia nigra compacta pars，SN（A9），腹側被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTN）（A10）[38]。其中位于的神經(jīng)元，主要投射到背外側紋狀體的尾狀核和殼核，其退行性病變將導致 PD[3]。SNc 區(qū)域的神經(jīng)元發(fā)出的上行纖維投射到紋狀體，形成黑質—紋狀體通路并分泌和釋放多巴胺，區(qū)域病變是造成帕金森癥的直接原因。VTN 區(qū)域的 DA 神經(jīng)元投射至伏隔核的邊緣形成中腦邊緣葉通路，它的過度活躍與精神分裂癥及藥物成癮有關。紅核后區(qū) DA 神投射至大腦前額葉皮層，與情緒和動機有關。

6圖 1.2 多巴胺神經(jīng)元的分化策略[28]Figure1.2 Protocols for the differentiation of mDAneurons.[28]多項研究證實，只有中腦區(qū)域特異性神經(jīng)細胞可以在移植部位很好的生存并起功能，雜質細胞會影響 TH+神經(jīng)元數(shù)量和行為改善效果。而且，EN1+的中腦特異多巴胺神經(jīng)細胞移植后在體內所生成 TH+神經(jīng)元的數(shù)量、體積及密度都是最佳的。因此，EN1 作為中腦黑

一定可以實現(xiàn)這一目的，帕金森病這類由特定細胞病變引起的疾病將能通過細胞替代得到有效治療。由于前述臨床級干細胞、功能性 DA 神經(jīng)元獲得技術取得重要進展，臨床級別條件分化的 DA 神經(jīng)元在嚙齒類和非人靈長類 PD 模型中顯示出令人鼓舞的結果，基于臨床級干細胞分化的 DA 神經(jīng)元移植治療帕金森病的臨床試驗條件已經(jīng)成熟[17,29]。但是，這種治療方法的推廣和普及尚面臨一定的問題，需要大量的臨床前和臨床研究對細胞治療的安全性和有效性進行全面評價。1. 細胞移植能否成為常規(guī)由于帕金森病的發(fā)病部位的特殊性和行使功能的重要性，治療上存在許多困難。要用細胞移植的方式治療帕金森病，需要通過神經(jīng)外科手術將細胞遞送到紋狀體區(qū)，特別是豆狀核的殼部。因此，即使干細胞治療的安全性和有效性得到充分的驗證，如何進一步優(yōu)化細胞治療的途徑，盡可能減少手術創(chuàng)傷，是有效推動細胞移植治療廣泛應用于臨床的重要前提之一。2. 哪種細胞來源更可能用于移植針對退行性變的細胞替代治療，將來主要會面臨著兩種選擇（圖 1.3，圖 1.4），是用胚胎干細胞分化的 DA 神經(jīng)元，還是用自體細胞進行重編程或轉分化獲得個性化的 DA 神經(jīng)元進行移植。

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本文編號：2816275