金黃色葡萄球菌是一種重要的機(jī)會型致病菌。該菌普遍存在于環(huán)境中,感染人體后,金葡菌通過分泌大量的毒力因子導(dǎo)致宿主機(jī)體器官被迅速破壞,引發(fā)膿皰病、毛囊炎、丘疹、疔瘡、膿腫和燙傷樣皮膚綜合征等多種皮膚類病變,或造成肺炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、敗血癥以及中毒性休克綜合癥等嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病,直至導(dǎo)致機(jī)體死亡。此外,金葡菌對外界抗生素、滅菌劑或其他不利于自身生長的條件具有較強(qiáng)的抵御和適應(yīng)能力。隨著耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)等多重耐藥金葡菌感染病例在全球逐年增多,金葡菌感染的臨床治療及新藥開發(fā)面臨越來越嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。形成生物被膜是金葡菌感受到外界不利于自身生長信號時的主要防御方式。通過生成生物被膜,金葡菌進(jìn)入接近休眠的持留菌狀態(tài),有效抵御人體免疫系統(tǒng)清除和滅菌劑滲入,使感染進(jìn)入難以治愈的慢性狀態(tài);另外,持留菌狀態(tài)還給予金葡菌足夠的時間來獲得新的抗性基因,最終進(jìn)化形成MRSA等多重耐藥型菌株。生物被膜形成及其調(diào)控機(jī)制的研究現(xiàn)已成為金葡菌治療領(lǐng)域的急迫需求之一。金葡菌的生物被膜形成受全局調(diào)控因子、雙組份調(diào)控系統(tǒng)和小非編碼RNA三類調(diào)節(jié)因子的共同調(diào)控。其中,全局調(diào)控因子SarA家族成員SarX蛋白可以通過影響ica系統(tǒng)及agr系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄,調(diào)控生物被膜形成。SarX蛋白可以通過抑制ica的抑制子icaR蛋白間接激活ica,促進(jìn)生物被膜主要成分PIA的合成,幫助生物被膜形成。SarX還可直接抑制agr轉(zhuǎn)錄,降低一百多種金葡菌胞外蛋白和毒力因子表達(dá),同時推動生物被膜形成。但目前研究僅發(fā)現(xiàn)SarX可以與agr的promoter區(qū)直接結(jié)合,其結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合方式等尚不清楚;該蛋白調(diào)節(jié)agr轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制也仍是一片空白。在本論文的第一部分研究工作中,我們以金葡菌SarX蛋白為研究對象,采用DNase Ⅰ酶解足跡法和凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)在agr promoter區(qū)找到了兩段長度為21 bp的SarX特異性結(jié)合位點(diǎn),并發(fā)現(xiàn)該結(jié)合過程中會出現(xiàn)多遷移條帶現(xiàn)象。為闡明上述結(jié)合過程的分子機(jī)制,我們采用X-射線晶體學(xué)的方法解析了2.0A分辨率的SarX蛋白結(jié)構(gòu)。SarX蛋白整體結(jié)構(gòu)與大多數(shù)SarA家族成員類似,在大面積的疏水作用力和氫鍵的作用下,兩個SarX單體組成一個“V”型的同源二聚體。使用化學(xué)交聯(lián)的實(shí)驗(yàn)方法,我們確定了這種晶體結(jié)構(gòu)中的同源二聚體也同樣存在于溶液狀態(tài)中,SarX以同源二聚體的形式發(fā)揮功能。通過SarX蛋白突變體的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn),我們確定了該蛋白“V”型二聚體分子的凹面負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合。通過原子力顯微鏡的實(shí)驗(yàn)手段,我們直接觀察了 SarX與agr promoter的相互作用情況,并發(fā)現(xiàn)在高濃度SarX蛋白條件下,SarX會與agr promoter DNA形成核酸蛋白纖維。在上述生化及結(jié)構(gòu)工作基礎(chǔ)上,我們使用分子對接方法得到了SarX與B型dsDNA之間可能的相互作用模型,提出了這種核酸蛋白纖維形成過程在agr轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中的可能機(jī)制。甲基化是生物體內(nèi)廣泛存在的一類生化反應(yīng),其生物功能非常廣泛,包括:生物合成、代謝調(diào)節(jié)、解毒作用、信號傳導(dǎo)、蛋白修飾、核酸修飾等。與種類繁多的甲基化底物相對應(yīng),自然界中進(jìn)化出了各式各樣的甲基轉(zhuǎn)移酶,鄰苯二酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)便是其中一類。在哺乳動物中,鄰苯二酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶被認(rèn)為與情緒、認(rèn)知、對壓力的反應(yīng)以及疼痛感知等生理現(xiàn)象有關(guān),且是一個重要的藥物設(shè)計靶點(diǎn)。在植物及細(xì)菌中,這類酶則負(fù)責(zé)部分主要代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物的合成。一直以來,真菌COMT的研究相對較少,但近年來發(fā)現(xiàn)裂殖酵母鄰苯二酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶spCOMT不同于其他同源物,可同時存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。這種特殊的細(xì)胞定位暗示細(xì)胞核中也存在該酶的天然底物。對spCOMT的深入研究將有助于我們發(fā)現(xiàn)該酶在細(xì)胞核內(nèi)執(zhí)行的生物學(xué)功能。在本論文的第二部分研究工作中,我們以裂殖酵母鄰苯二酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶spCOMT為研究對象,首先在體外以七葉亭(esculetin)為底物驗(yàn)證了該酶的酶學(xué)活性及其催化活性對Mg2+的依賴性。通過X-射線晶體學(xué)方法解析了2.2A分辨率的spCOMT單體結(jié)構(gòu)和2.0A分辨率的spCOMT-SAM復(fù)合物結(jié)構(gòu)。結(jié)合上述結(jié)構(gòu)信息和突變體等溫量熱滴定實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)spCOMT甲基供體SAM結(jié)合口袋的氨基酸殘基具有組成特異性,單個位點(diǎn)的殘基突變即可使其結(jié)合SAM的能力接近消失。我們推測這一特點(diǎn)可能與結(jié)合SAM時需要同時固定其甲硫氨酸、腺嘌呤和糖環(huán)三個部分有關(guān)。此外,我們還發(fā)現(xiàn)在spCOMT結(jié)合甲基受體的底物口袋中,與鄰苯二酚頭部結(jié)合的區(qū)域在同源蛋白中高度保守,但其口袋邊緣部分長度更長、柔性更強(qiáng),提示spCOMT的天然底物可能是一類含鄰苯二酚頭部和可變尾部長度的分子。
【學(xué)位單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R378.11
【部分圖文】：

是一個多次跨膜蛋白，被推測與ＰＩＡ向細(xì)胞膜外的運(yùn)輸相關(guān)［３２，邋３５］。由／0？系統(tǒng)逡逑控制合成的ＰＩＡ被認(rèn)為是生物膜形成時菌體附著的主要貢獻(xiàn)者［３６］，因此／ｃａ系逡逑統(tǒng)被認(rèn)為是生物被膜合成的重要調(diào)控因子（圖１．２）。逡逑３逡逑

￣逡逑Ｐｏｔｙ／＾ｃｖｔｙｌｇｌｕｃｏＭｉｎｂｎ邋（ＰＮＡＧ｝逡逑圖１．２邋Ｗ操縱子合成ＰＩＡ／ＰＮＡＧ示意圖逡逑注：左圖中ｉｃａＡ、ｉｃａＤ、ｉｃａＣ和ｉｃａＢ蛋白分別使用不同顏色形狀代表。該圖片引用自Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ逡逑Ｙ．Ｌｅ邋等［３７］。逡逑ＳａｒＡ家族包含多個成員，目前研宄最清楚的是其家族代表：ＳａｒＡ蛋白。ＳａｒＡ逡逑蛋白被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)ｂｉｏｆｉｌｍ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ（Ｂａｐ）的轉(zhuǎn)錄［３８］，由于Ｂａｐ被認(rèn)逡逑為在生物被膜形成的最初粘附和細(xì)胞積累過程中起到重要作用［３９］，因此ＳａｒＡ可逡逑以促進(jìn)生物被膜的形成。除此之外，ＳａｒＡ蛋白還被發(fā)現(xiàn)可通過對核溶解酶和蛋逡逑白溶解酶的抑制，促進(jìn)菌體的附著和早期生物膜的形成［４０］。根據(jù)報道，轉(zhuǎn)逡逑錄本在形成生物被膜的菌體中明顯增加［４１］；而在基因缺陷的金葡菌中生物逡逑被膜形成能力明顯減弱［４２］。更多關(guān)于ＳａｒＡ家族成員對生物被膜調(diào)節(jié)的描述將逡逑在下個章節(jié)中展開。逡逑Ｊｇｒ是一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，該系統(tǒng)由Ｐｅｎｇ邋ＨＬ等首次報道［４３］�？删幋a逡逑ＲＮＡＩＩ邋和邋ＲＮＡＩＩＩ邋兩個分子［４４］（圖邋１．３），其中邋ＲＮＡＩＩ邋由邋Ｐ２ｐｒｏｍｏｔｅｒ邋起始，ＲＮＡＩＩＩ逡逑由Ｐ３邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ起始。ＲＮＡＩＩ負(fù)責(zé)編碼ＡｇｒＡ、ＡｇｒＣ、ＡｇｒＤ和ＡｇｒＢ四個蛋白

ＲＮＡＩＩＩ的３’端結(jié)構(gòu)域被發(fā)現(xiàn)可以在指數(shù)后期抑制金葡菌表面的一些分泌蛋白的逡逑表達(dá)，進(jìn)而抑制生物被膜的形成［６４］。ＲＮＡＩＩＩ的１端結(jié)構(gòu)域調(diào)控目標(biāo)基因的原理逡逑如下圖１．４所示。逡逑ＲＮＡＩＩ逡逑Ｔ邐…？一邐ｒ逡逑０邋ｆ邐ｉ邐ｙｒ邐Ｉ邐ＲＮＡ＂丨邐１邋二＂ＳＵ逡逑．Ｈ邋ａ邋Ｔ邐個邐，邐＋邐１邋Ｕ２３Ｓ３邋（ＳｍＡ－ＨＭ逡逑ＭｆＯＯＯ／ｍｐ？邋ｍＡＮＡｓ邐Ｈｂｏ？ｏｍ？邐ＲＮａ？？邋ｉＨ邐Ｆｕｒｔｈｅｒ邋ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ邐Ｉ邐ｉＰｒｏｔ？？ｎ邋Ａ）逡逑ｉ邐Ｎ邐Nｚ逡逑Ｍ，ｉＨ－邋ｎｎｒ邋ｉｎｒ逡逑，Ａ邐ｙ邋＾邐ｆ｜ｊ邐——？邐ｆｉｇ邐N逡逑＾邐ｆｔ邐－邋ｆｉｔ邐＊ｐＭ／＾Ｓ？ｒｔｒ？ｅｐｒｏｔｅ＊？？？）逡逑Ｉｌｆ邐ｉ逡逑Ａ邋？邋ｕ邐丨“邐Ｈ邐邐邋—ｉＭ邋？？0－■■■■邋ｂ逡逑ｒｏｔ邋ｍＲＭＡ逡逑圖１．４邋ＲＮＡＩＩＩ３端非編碼ＲＮＡ調(diào)控示意圖逡逑注：圖中分別為ＲＮＡＩＩＩ３＇端與目標(biāo)ｍＲＮＡ以一個或兩個ｌｏｏｐ環(huán)互補(bǔ)配對，導(dǎo)致擴(kuò)展出一段逡逑不規(guī)則雙鏈，這種結(jié)構(gòu)將抑制核糖體的結(jié)合并使ＲＮａｓｅｌｌｌ對其進(jìn)行降解，最終抑制相關(guān)基逡逑因的表達(dá)。該圖片引用自ＳａｎｄｒｉｎｅＢｏｉｓｓｅｔ等［６４］。逡逑１．３全局調(diào)控因子ＳａｒＡ家族逡逑全局調(diào)控因子ＳａｒＡ家族是金葡菌生物被膜形成過程中一類重要的調(diào)節(jié)因子。逡逑該家族中的典型代表ＳａｒＡ蛋白是金葡菌中的一個轉(zhuǎn)錄因子，其被發(fā)現(xiàn)可以通過逡逑與被調(diào)控基因啟動子區(qū)域的結(jié)合來調(diào)節(jié)這些基因的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)現(xiàn)有報道，ＳａｒＡ蛋逡逑白可以對纖維連接蛋白結(jié)合蛋白Ａ／Ｂ邋（ｆｎｂＡ／ｆｎｂＢ）和毒素蛋白（ａ

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1 王晴;金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)錄因子SarX蛋白及裂殖酵母鄰苯二酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶spCOMT的結(jié)構(gòu)和功能研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2019年

本文編號：2815929