發(fā)布時(shí)間：2020-09-10 09:17

　　 偏頭痛是一種復(fù)雜的、由神經(jīng)系統(tǒng)紊亂引發(fā)的、具有周期性、致殘性、反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)的持續(xù)或間歇性頭痛疾病,是繼高位截癱、精神分裂癥、癡呆癥之后的又一例被世界衛(wèi)生組織列為嚴(yán)重影響患者工作和生活的致殘性疾病,其嚴(yán)重性和影響力可見一斑。正因如此針對偏頭痛的發(fā)病機(jī)制及治療方法的研究也變得刻不容緩。隨著數(shù)十年的研究和發(fā)展,偏頭痛的發(fā)病機(jī)制由最初的“血管學(xué)說”轉(zhuǎn)變?yōu)槿缃窀鼮槌墒臁⒏哒f服力的“神經(jīng)學(xué)說”,并且逐漸發(fā)現(xiàn)和證實(shí)了降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin Gene-related Peptide簡稱CGRP)在引發(fā)偏頭痛中的重要生理作用。自此之后,抗CGRP或其受體的單克隆抗體藥物作為替代傳統(tǒng)偏頭痛治療方式的新型治療方法開啟了偏頭痛預(yù)防和治療的新篇章。本研究以抗CGRP的抗體(Anti-CGRP antibody)Fremanezumab為基礎(chǔ),根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性對其Fab(Fragment of antigen-binding)片段的基因序列進(jìn)行優(yōu)化并合成,利用本實(shí)驗(yàn)室建立的抗體Fab片段表達(dá)系統(tǒng),基于實(shí)驗(yàn)過程中的具體問題進(jìn)行優(yōu)化,從最初的信號(hào)肽引導(dǎo)的周質(zhì)分泌到優(yōu)化后的培養(yǎng)基分泌,實(shí)現(xiàn)了Fab片段的高效可溶性表達(dá),并且保證了Fab片段重輕鏈之間二硫鍵的正確形成。利用Protein L純化介質(zhì)對人抗體κ輕鏈的特異性結(jié)合的特點(diǎn),對誘導(dǎo)表達(dá)后所得培養(yǎng)基進(jìn)行初步親和純化,所得Fab產(chǎn)品相對于誘導(dǎo)菌液體積的產(chǎn)量約10 mg/L即誘導(dǎo)培養(yǎng)體積為1 L的菌液,處理純化其培養(yǎng)基可得到約10 mg的Fab產(chǎn)品,并通過PhotoShop軟件對Fab產(chǎn)品的SDS-PAGE檢測結(jié)果進(jìn)行灰度分析計(jì)算得出Fab純度約60%。基于初次純化純度較低的問題,本研究采用了Nano SP陽離子交換介質(zhì)進(jìn)行二次精細(xì)純化,所得產(chǎn)品經(jīng)同樣的分析方法得出Fab純度達(dá)83%,并根據(jù)精細(xì)純化前后Fab總量計(jì)算二次精細(xì)純化后收率為62%。最終產(chǎn)品抗CGRP抗體Fab片段在下文中簡寫為ACFab。基于Fab片段分子量小、體內(nèi)半衰期短等缺陷,結(jié)合蛋白質(zhì)分子PEG修飾的原理和方法,本研究采用了Fab片段的定點(diǎn)PEG修飾即在Fab片段的重鏈末端引入半胱氨酸提供一個(gè)游離的巰基,經(jīng)適當(dāng)還原劑還原后與PEG-馬來酰亞胺(PEG-MAL)在正交實(shí)驗(yàn)所得最佳條件下進(jìn)行修飾反應(yīng),并對修飾后產(chǎn)物進(jìn)行陽離子交換純化獲得純度為97%的Fab-PEG修飾產(chǎn)物。最終采用非競爭性Elisa法檢測ACFab及其PEG修飾產(chǎn)物的抗原抗體結(jié)合曲線和抗體親和常數(shù)。其中ACFab親和常數(shù)為(7.52±1.57)*10~7M~(-1)、ACFab-PEG修飾產(chǎn)物親和常數(shù)為(2.90±0.25)*10~7M~(-1),由此確定了抗CGRP抗體Fab及其PEG修飾產(chǎn)物對抗原CGRP多肽的結(jié)合活性及能力,證明了本研究中ACFab原核表達(dá)純化及PEG修飾方案的可行性,為后續(xù)的研究及ACFab的大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R392-33
【部分圖文】：

第一章 引言廣泛應(yīng)用[26]。其次有研究表明 CGRP 能夠影響膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌進(jìn)而影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元；CGRP 還能促進(jìn)神經(jīng)再生，是一種對神經(jīng)細(xì)胞具有較強(qiáng)調(diào)節(jié)保護(hù)作用的多肽[27]。隨著對 CGRP 研究的深入以及對偏頭痛發(fā)病機(jī)制的探索發(fā)現(xiàn)，CGRP 與偏頭痛的發(fā)作也有一定的關(guān)系，并且逐漸被用作治療偏頭痛的新的靶點(diǎn)[28]。

圖 1.2 CGRP 參與偏頭痛的病理生理關(guān)系圖[1]因此 CGRP 及其受體作為治療偏頭痛的新型特異性靶點(diǎn)，通過阻斷 CGR與其受體結(jié)合的路徑來治療和預(yù)防偏頭痛的新策略應(yīng)運(yùn)而生，各種 CGRP 受拮抗劑及抗 CGRP 及其受體的抗體藥物的研發(fā)也成為近幾年偏頭痛臨床治療的熱點(diǎn)[35]。尤其在 2018 年，CGRP 單克隆藥物的研發(fā)取得了優(yōu)異的成績。其CGRP 與其受體結(jié)合過程及作用效果見圖 1.3 所示，CGRP 抗體通過與突觸后

圖 1.3 CGRP 與其受體結(jié)合過程示意圖[36] CGRP 抗體抗 CGRP 抗體在偏頭痛治療中的作用的預(yù)防治療偏頭痛的方法幾乎都不是針對偏頭痛而研發(fā)的，往往故而傳統(tǒng)療法在特異性和病人的耐受性方面都不能讓人滿意[37-38，偏頭痛是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂疾病，其中起關(guān)鍵作用的就是的活化和敏化反應(yīng)，而三叉神經(jīng)系統(tǒng)的刺激導(dǎo)致了神經(jīng)肽尤其是關(guān)肽的釋放，同時(shí) CGRP 也被確認(rèn)為偏頭痛發(fā)作的誘發(fā)因子和增CGRP 被確定為偏頭痛的靶點(diǎn)后，也展開了對 CGRP 受體的鑒定， 及其受體功能阻斷的偏頭痛新型治療方法[40]。最初出現(xiàn)的是一種 C劑，CGRP8-37[41]。在 CGRP8-37的功能得到肯定后，Doods[42]等人相

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