[目的]通過間接共培養(yǎng)的方法初步探討人脫落乳牙牙髓干細胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)在體外促進破骨前體細胞向破骨細胞分化的能力及其影響機制。[方法]通過酶消化法體外分離培養(yǎng)處于生理性根吸收時期的自然脫落乳牙牙髓干細胞;建立SHED與破骨前體細胞(外周血單個核細胞,peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)的間接共培養(yǎng)模型,共培養(yǎng)3、7、10、14天。利用TRAP染色觀察PBMCs向破骨細胞樣細胞分化后的細胞數(shù)目與形態(tài),利用實時定量RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測破骨相關(guān)基因TRAP、CTSK、c-Fos、TRAF6的表達,以評估PBMCs向破骨細胞樣細胞分化的情況。在間接共培養(yǎng)模型中加入0、5、10、50、100ng/mL 不同濃度的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),通過實時定量RT-PCR和Western bolt檢測破骨相關(guān)基因及核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路相關(guān)基因的表達。利用TNF-α(10ng/mL)模擬炎癥微環(huán)境,利用BAY11-7082抑制NF-κB信號通路,檢測RANKL/OPG以及NF-κB相關(guān)基因在SHED受到炎癥微環(huán)境作用后的變化。[結(jié)果]與PBMCs單獨培養(yǎng)組相比,在SHED與PBMCs間接共培養(yǎng)模型中,TRAP染色陽性、具有多個核的破骨細胞樣細胞數(shù)量顯著增多,破骨相關(guān)基因TRAP、CTSK、c-Fos、TRAF6在PBMCs中的表達水平顯著上調(diào)。在一定濃度TNF-α刺激下,破骨相關(guān)基因CTSK、TRAP在PBMCs中的表達水平顯著上調(diào);RANKL、RANKL/OPG比值、細胞胞漿內(nèi)p-IκBα和胞核內(nèi)p65在SHED中的表達水平顯著上調(diào)。在TNF-α刺激的同時加入BAY11-7082后,破骨相關(guān)基因表達水平下調(diào)。[結(jié)論]SHED能夠促進破骨前體細胞向破骨細胞樣細胞分化。在炎癥微環(huán)境影響下,SHED的促進破骨細胞形成能力增強,;TNF-α能活化NF-κB信號通路,上調(diào)NF-κB相關(guān)基因的表達,通過調(diào)節(jié)RANKL/OPG的表達增強SHED的促進破骨細胞形成能力,這可能促進了牙根吸收導致乳牙生理性脫落。
【學位單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R333.1
【部分圖文】：

２．１邋ＳＨＥＤ原代分離、培養(yǎng)、純化逡逑乳牙牙髓組織通過酶消化法分離得到原代細胞，培養(yǎng)７天后可見多個克隆樣的逡逑細胞團形成，細胞貼壁生長，具有多形性，呈短梭形、多角形等形狀（圖１Ａ）。逡逑通過有限稀釋法挑選單個細胞，培養(yǎng)１４天左右時，鏡下可見多個細胞團匯集成片，逡逑細胞排列似漩渦、束狀，此為純化的形態(tài)均一的ＳＨＥＤ邋（圖１Ｂ）。逡逑２１逡逑

Ｂ：純化培養(yǎng)后細胞聚集成片似漩渦（倒置像差顯微鏡，ｘ邋１0０）逡逑２．２邋ＳＨＥＤ間充質(zhì)干細胞特性的鑒定逡逑經(jīng)過１４天的成骨誘導后，可見大量紅染的礦化結(jié)節(jié)（圖２邋Ａ、Ｂ）；經(jīng)過１４天逡逑常規(guī)培養(yǎng)，可見藍染的克隆形成單位（圖２邋Ｃ、Ｄ）；經(jīng)過２８天的成軟骨誘導后，逡逑實驗組可見藍染的粘多糖（圖２邋Ｅ）；經(jīng)過１４天成脂誘導后，細胞在鏡下可見脂滴逡逑形成（圖２Ｆ）；流式細胞分析儀結(jié)果顯示，ＳＨＥＤ陽性表達了邋ＣＤ９０、ＣＤ１０５、逡逑Ｓｔｒｏ－１，而未表達ＣＤ３４、ＣＤ４５。以上結(jié)果表明ＳＨＥＤ具有間充質(zhì)干細胞的基本特性逡逑（圖邋３）。逡逑２２逡逑

＿邋＿逡逑圖２邋ＳＨＥＤ多向分化及克隆形成逡逑：成骨誘導１４天，茜素紅染色（倒置像差顯微鏡，ｘｌ00）；逡逑：常規(guī)培養(yǎng)１４天，克隆形成（倒置像差顯微鏡，ｘｌ00）；逡逑成軟骨誘導２８天，阿利辛藍染色（倒置像差顯微鏡，ｘ２00）；逡逑成脂誘導１４天，油紅Ｏ染色（倒置像差顯微鏡，ｘ４00）逡逑Ｉ邋９９．６０％邐Ｔ邋９５．１０％—９．１０％逡逑

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳小燕;丁寅;金巖;;TNF-α通過NF-κB信號通路對人牙周膜干細胞成骨分化調(diào)控作用的研究[J];口腔生物醫(yī)學;2015年03期

2 楊杰;趙玉鳴;葛立宏;;恒牙胚缺失動物模型的建立及相應(yīng)乳牙牙根的吸收[J];北京大學學報(醫(yī)學版);2008年01期

本文編號：2815341