目前在側支循環(huán)的研究中,多集中在急性缺血方面,而對慢性缺血側支循環(huán)的研究卻較少。將兩者進行對比研究未見有報道。隨著近年來基因技術、分子生物學和基因測序技術的進步,發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA在細胞的增殖、分化、代謝凋亡等方面有著重要的調控作用,人類疾病的發(fā)生、發(fā)展也和它有密切關系。特別在血管內皮細胞和血管平滑肌的研究中發(fā)現(xiàn)lncRNA在許多方面對其有調控作用。側支循環(huán)建立形成的基因調控目前仍未完全清楚,并且大部分研究集中于mRNA。lncRNA調控側支循環(huán)的研究卻鮮有報道。因此我們構建了大鼠急性和慢性缺血模型,進一步觀察大鼠急性或者慢性缺血狀態(tài)下顱內各個血管變化進一步尋找可能的影響因素。同時對大鼠腦缺血區(qū)的腦血管做了二代的RNA-seq高通量測序。我們試圖在大鼠腦急性缺血模型和慢性缺血模型中尋找在血管生成和側支循環(huán)形成的異同,為可能的基因調控靶點提供一些證據(jù)。第一部分大鼠急性、慢性缺血模型及側支循環(huán)的建立試驗方法:建立大鼠MCAO模型和慢性缺血模型,選成年雄性Wistar健康大鼠,隨機分成三組:A組(假手術組),B組(MCAO模型組),C組(慢性缺血組)。所有大鼠造模后均行激光散斑成像觀察,分別于蘇醒后2小時、12小時、24小時、48小時、72小時和1周每個時間段行神經(jīng)功能評分,后4個階段每組處死3只大鼠取腦,行HE和CD105染色,觀察腦側支循環(huán)建立和血管生成。結果:TTC染色示:B組梗死面積百分比達到20.30±4.62%,C組梗死面積百分比為3.02±1.26%。激光散斑血流圖示:在A組造模后,腦血流無明顯變化。B組在MCAO側腦灌注明顯減少,降幅達60%以上,在梗死后軟膜動脈既開放向缺血區(qū)供血。C組全腦灌注明顯減低達50%以上,早期大腦中、大腦前仍有血流,較前明顯減少。HE染色B組腦組織水腫,病變區(qū)血管充血擴張大量神經(jīng)細胞死亡,C組在部分可見有少量血管充血,大腦皮層及海馬區(qū)可見部分神經(jīng)細胞變性皺縮壞死,結構稀疏。CD105染色示在B組梗死核心區(qū)和梗死灶周邊均有新生血管生成,梗死灶周邊明顯,隨著梗死時間延長新生血管逐漸增多,7天時最多。C組也有新生血管生成,相對B組較少。第二部分缺血后大鼠腦血管差異表達RNA研究試驗方法:建立大鼠MCAO模型和慢性缺血模型,選成年雄性Wistar健康大鼠,隨機分成三組:A組(假手術組),B組(MCAO模型組),C組(慢性缺血組)。模型建立后48小時處死大鼠,立刻取右側缺血區(qū)腦血管,提取RNA,行二代高通量RNA-seq測序。利用Ballgown對兩組轉錄本進行比較,尋找差異基因,應用KEGG數(shù)據(jù)庫進行GO分析、pathway分析,構建信號傳導網(wǎng)絡(signal-net)分析和lncRNA與mRNA共表達網(wǎng)絡(lncRNA-mRNA-net)分析。qRT-PCR驗證RNA-seq測序結果。結果:1、急性缺血組與對照組lncRNA與mRNA的分析:較篩選出差異lncRNA 71個差異基因,其中34個上調,37個下調。mRNA有1963個,其中上調的有1142個,下調821個。在mRNA相互作用網(wǎng)絡中,與血管生成相關的mRNA中,基因Tek、Kdr、Plcb4和Plcg1在整個調控網(wǎng)絡起到了非常重要作用。Tek、Kdr能夠通過激活Plcb4對Prkce、Prkcb、Prkca、Itpr1、Pla2g4a、Mapk13和Mapk11組成的網(wǎng)絡進行調控。Kdr也能夠通過Plcg1對上述網(wǎng)絡進行調控。Itgb2能夠通過調控Fgf2來影響Adcy5繼而影響上述調控網(wǎng)絡。ENSRNOT00000036680、ENSRNOT00000084727同時對Plcg1調控,前者為正向調控,后者為負向調控。Tek未發(fā)現(xiàn)有l(wèi)ncRNA調控,對Kdr調控的lncRNA有三個,其中ENSRNOT00000077132調節(jié)能力最強為負向調控,ENSRNOT00000092096為正向調控。ENSRNOT00000073655對Plcb4進行負向調控。ENSRNOT00000087051對Adcy5進行正向調控。2、慢性缺血組與對照組lncRNA與mRNA的分析:篩選出差異lncRNA276個差異基因,其中66個上調,160個下調。mRNA有3289個,其中上調的有1776個,下調1513個。在mRNA的相互作用網(wǎng)絡中,與血管生成有關的mRNA中,Mapk1、Prkca同Nras和Kras構成了主要的相互作用網(wǎng)絡。Nras、Kras與Mapk1將作用更密切并能調控Mapk8、Mapk9。我們推測在慢性缺血的過程中血管的生成主要是通過對Mapks調控。通過lncRNA與mRNA共表達網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)ENSRNOT00000092872對Kras進行負向調控,ENSRNOT00000076004對Nras調控。對Mapk1調控的lncRNA中作用最強的是ENSRNOT00000090397和ENSRNOT00000076495,前者為負向調控。ENSRNOT00000092832對Prkca進行調控。3、慢性缺血組與急性缺血組lncRNA與mRNA的分析對比急性和慢性缺血組的RNA數(shù)據(jù)分析:在有血管生成有關的mRNA中,在兩組中均有表達的有330個。差異表達在4倍以上的有21個。Kcnab2、Atp6v1g2、Stmn4、Stim1、Cyp1b1、Fgf2等差異基因兩組之間是反向調節(jié),而Kng2在兩組之間均為上調但B組差異倍數(shù)更顯著。B組與C組之間GO分析和pathway分析對比發(fā)現(xiàn),Kcnab2、Stmn4僅在C組中有顯著性差異。Stim1、Cyp1b1僅在C組中有顯著性差異。Atp6v1g2在離子跨膜運輸功能上B組為下調,C組上調,代謝通路上B組為下調,C組上調。從上數(shù)據(jù)我們可以看出,Kng2、Fgf2和Atp6v1g2在B、C兩組中具有相同的功能,相同的調控通路。ENSRNOT00000087079在調控Stmn4的lncRNA中調控能力最強。ENSRNOT00000002990對Serpine1負向調控,但在C組中ENSRNOT00000076446的調控能力較ENSRNOT00000002990強,正向調控。對Kng2的調控兩組沒有相同的lncRNA。在兩組中ENSRNOT00000079300對lgf1調控均為負向調控。ENSRNOT00000092605對Atp6v1g2在兩組中均為正向調控,但在C組中ENSRNOT00000089288的調控能力較ENSRNOT00000092605強,負向調控。結論:1、急性梗死超早期的側支循環(huán)建立以固有動脈為主,如Willis動脈環(huán),軟膜動脈。梗死后血管新生發(fā)生在24h內出現(xiàn),隨著梗死時間延長,血管新生越明顯,7天時仍有明顯血管新生。血管新生在梗死灶核心和周邊均有,周邊明顯增多。慢性血管狹窄顱內側支循環(huán)的建立主要以固有動脈為主,也存在部分血管新生但較急性腦梗死少。2、急性缺血模型中Tek、Kdr、Plcb4、Plcg1對血管生成有重要調控作用,可能是通過VEGF信號通路、PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路等通路調控進行調控,其中Mapks信號通路作用可能更明顯。ENSRNOT00000077132、ENSRNOT00000092096和ENSRNOT00000073655對上述mRNA起到了調節(jié)作用。3、慢性缺血模型中Mapk1、Prkca、Nras和Kras等基因在其中起到了重要作用調控作用,其PI3K-Akt信號通路和Mapk信號通路在其中貢獻較大。ENSRNOT00000092872、ENSRNOT00000076004和ENSRNOT00000092832等lncRNA對上述mRNA的調控作用強。4、Kng2、Fgf2和Atp6v1g2在B、C兩組中具有相同的功能,相同的調控通路。在兩組中ENSRNOT00000079300對lgf1調控均為負向調控。ENSRNOT00000092605對Atp6v1g2在兩組中均為正向調控,但在C組中ENSRNOT00000089288的調控能力較ENSRNOT00000092605強,負向調控。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R743;R-332

【參考文獻】

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1 張銘;紀玉強;謝梅;王楠;趙朝;;長鏈非編碼RNA(lncRNA)在氧化型低密度脂蛋白誘導血管內皮細胞損傷中表達譜的變化[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2015年30期

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3 李堯;龔浠平;王擁軍;李征;;頸動脈狹窄閉塞性病變時側支循環(huán)的開放特征[J];中國臨床康復;2006年28期

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1 井珍;慢性腦缺血導致血管重塑、血流動力學變化、神經(jīng)元變性和認知功能損傷[D];暨南大學;2015年

本文編號：2815104