研究背景:我們前期實(shí)驗(yàn)表明可產(chǎn)生白細(xì)胞介素-17(IL-17)的同種反應(yīng)性T細(xì)胞在小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)早期階段發(fā)揮主要作用,阻斷IL-17可明顯延長心臟移植物存活時(shí)間。Toll樣受體2(TLR2)在不同疾病模型和條件下對Th17細(xì)胞的分化發(fā)揮著不同的作用。TLR2信號通路對經(jīng)過同種抗原刺激后所產(chǎn)生的IL-17+T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用尚未見報(bào)道。研究目的:在本研究中,我們使用小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)模型來研究器官移植受者小鼠TLR2基因敲除對急性排斥反應(yīng)的影響,以及TLR2信號通路對同種反應(yīng)性IL-17+T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。研究方法:1.小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)模型的制備:采取腹部異位小鼠心臟移植模型。在急性排斥反應(yīng)模型中,供者為BALB/c小鼠,受者為C57背景的野生型小鼠(WT)或TLR2基因敲除小鼠(TLR2---)。在同系移植模型中,供者為C57野生型小鼠,受者為C57背景的WT小鼠或TLR2-/-小鼠。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相關(guān)的檢測方法與指標(biāo):(1)記錄各組心臟移植物生存曲線;HE染色檢測心臟移植物炎性細(xì)胞浸潤及心肌損害情況,并采用國際心臟與肺移植協(xié)會(ISHLT)心臟移植物急性排斥反應(yīng)病理評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分;(2)免疫組織化學(xué)染色法檢測心臟移植物中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤;(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟和心臟移植物中IL-17+CD3+T細(xì)胞、IL-17+CD4+T細(xì)胞(Th17)、IL-17+γδT細(xì)胞、IL-17+CD8+T細(xì)胞、IFN-γ+T細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等細(xì)胞群的變化;(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟樹突狀細(xì)胞(DC)和巨噬細(xì)胞中IL-6的表達(dá)情況;(5)熒光定量PCR法檢測心臟移植物中IL-17A、IL-6、IL-1β、TNF-α、CCL20、CCR6、IL-10、IL-4、IFN-γ等細(xì)胞因子的表達(dá);(6)蛋白免疫印跡法檢測脾臟和心臟移植物STAT3和p-STAT3的水平。3.體外實(shí)驗(yàn)相關(guān)的檢測方法與指標(biāo):(1)將受者來源T細(xì)胞和供者來源BMDC的混合培養(yǎng),應(yīng)用IL-6和TGF-β刺激,流式細(xì)胞術(shù)檢測TLR2-/-和WT組Th17及IL-17+γδT細(xì)胞的變化;(2)將受者來源脾細(xì)胞和供者來源BMDC進(jìn)行混合培養(yǎng),流式細(xì)胞術(shù)檢測TLR2-/-WT組Th17及IL-17+γδT細(xì)胞的變化;ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6的水平;(3)將受者來源脾細(xì)胞和供者來源BMDC的混合培養(yǎng),應(yīng)用IL-6抗體阻斷后,流式細(xì)胞術(shù)檢測TLR2-/-和WT組Th17及IL-17+γδT細(xì)胞的變化。研究結(jié)果:1.本研究成功建立同種異體小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)模型;2.受者TLR2敲除后,對小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)產(chǎn)生如下影響:(1)受者TLR2敲除導(dǎo)致心臟移植物中炎性細(xì)胞浸潤增多,心肌損害加重,排斥反應(yīng)加劇;(2)受者TLR2敲除導(dǎo)致心臟移植物中中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤增加;(3)TLR2缺失促進(jìn)受者脾臟同種反應(yīng)性Th17細(xì)胞和IL-17+γδT細(xì)胞比例增加,心臟移植物中同種反應(yīng)性Th17細(xì)胞、IL-17+γδT細(xì)胞及總T細(xì)胞數(shù)量增加。(4)TLR2缺失對IFN-γ+T細(xì)胞(包括Th1細(xì)胞)無明顯影響;(5)受者TLR2敲除可上調(diào)同種心臟移植物中IL-17A、IL-6、IL-1β、TNF-α、CCL20及CCR6的表達(dá);3.小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)中,受鼠TLR2缺失促進(jìn)DC分泌IL-6增多,從而導(dǎo)致同種反應(yīng)性IL-17+T細(xì)胞增加,具體包括:(1)T細(xì)胞本身TLR2缺失不會影響T細(xì)胞經(jīng)過同種抗原刺激后,同種反應(yīng)性Th17細(xì)胞和IL-17+γδT細(xì)胞的分化能力;(2)IL-6促進(jìn)TLR2-/-組同種反應(yīng)性Th17細(xì)胞和IL-17+γδT細(xì)胞的分化,阻斷IL-6可使TLR2-/-組同種反應(yīng)性Th17細(xì)胞和IL-17+γδT細(xì)胞比例明顯降低;(3)小鼠心臟移植排斥反應(yīng)中,TLR2敲除導(dǎo)致DC分泌IL-6增加。4.TLR2敲除導(dǎo)致受鼠脾臟和移植物中STAT3磷酸化增加;5.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明,TLR2敲除導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增減少。研究結(jié)論:1.受者TLR2敲除可加重小鼠心臟移植排斥反應(yīng);2.受者TLR2敲除可促進(jìn)同種反應(yīng)性Th17細(xì)胞和IL-17+γδT細(xì)胞應(yīng)答;3.受者TLR2敲除促進(jìn)DC分泌IL-6增加,從而促進(jìn)Th17細(xì)胞和IL-17+γδT細(xì)胞分化。同時(shí),TLR2敲除可導(dǎo)致STAT3磷酸化增加;4.TLR2信號通路在同種移植排斥反應(yīng)中的作用值得進(jìn)一步的關(guān)注。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R654.2;R-332
【部分圖文】：

圖１心臟移植物病理學(xué)檢測逡逑在移植手術(shù)武S猓程歟停旱冢誹歟直鶇櫻呱褚浦步悖ǎ粒歟歟錚紓澹睿澹椋悖屯刀躍驘a（Ｓｙｎｇｅ提取心臟移植物弁進(jìn)坓常規(guī)Ｈ＆Ｅ染色（放大倍數(shù)４００）？每組３只小鼠，進(jìn)行３次獨(dú)立逡逑實(shí)驗(yàn)。逡逑３、心臟移植排斥反應(yīng)病理評分逡逑根c玻甒：際心臟與肺移楦協(xié)會（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ邋Ｓｏｃｉｅｔｙ邋ｏｆ邋Ｈｅａｒｔ邋ａｎｄ邋Ｌｕｎｇ逡逑Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＩＳＨＬＴ）制定的＇心臟移植物急性排斥反應(yīng)病理評分標(biāo)準(zhǔn)對各組進(jìn)逡逑行評分。結(jié)果如圖２所示在移植后第３天，同種移植ＷＴ組ＩＳＨＬＴ評分為１，逡逑為輕度排斥反應(yīng)；而間種移植ＴＬＥ＾ｔａｉＳＨＬＴ評分為２，即中度排斥反應(yīng)．。在逡逑第７天，同種移植ＷＴ組和ＴＬＲ２ｖｔａ邋ＩＳＨＬＴ評分都達(dá)到３，即重度排斥反應(yīng)。逡逑于此同時(shí)，．同系對照ＷＴ組和ＴＬＲ２＋組在第３夭和７夫評分都為０，沒有發(fā)生排逡逑

根c玻甒：際心臟與肺移楦協(xié)會（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ邋Ｓｏｃｉｅｔｙ邋ｏｆ邋Ｈｅａｒｔ邋ａｎｄ邋Ｌｕｎｇ逡逑Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＩＳＨＬＴ）制定的＇心臟移植物急性排斥反應(yīng)病理評分標(biāo)準(zhǔn)對各組進(jìn)逡逑行評分。結(jié)果如圖２所示在移植后第３天，同種移植ＷＴ組ＩＳＨＬＴ評分為１，逡逑為輕度排斥反應(yīng)；而間種移植ＴＬＥ＾ｔａｉＳＨＬＴ評分為２，即中度排斥反應(yīng)．。在逡逑第７天，同種移植ＷＴ組和ＴＬＲ２ｖｔａ邋ＩＳＨＬＴ評分都達(dá)到３，即重度排斥反應(yīng)。逡逑于此同時(shí)，．同系對照ＷＴ組和ＴＬＲ２＋組在第３夭和７夫評分都為０，沒有發(fā)生排逡逑斥反應(yīng)》隊(duì)土結(jié)果提示，ＴＬＲ２基因敲除可導(dǎo)致小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)早期逡逑移植物中炎性細(xì)胞浸潤增多及排斥反應(yīng)加灄ａ逡逑２６逡逑

Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ邐Ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ逡逑圖２心臟移植排斥反應(yīng)病理學(xué)評分逡逑根據(jù)ＩＳＨＬＴ制定的心臟移植物急性排斥反應(yīng)病理評分標(biāo)準(zhǔn)對各組進(jìn)行評分，分值越高逡逑排斥反應(yīng)越嚴(yán)童，每組３只小鼠，進(jìn)行３次獨(dú)立驗(yàn)。逡逑４、心臟移植物存活曲線逡逑移植手術(shù)后對受鼠每日行腹部觸診，評估心臟搏動(dòng)，記錄移植物存活時(shí)間。逡逑結(jié)果如祖３所示，同種移植ＷＴ組平均存活天數(shù)為６．７０±０．２１天，同種移植ＴＬＲ２＿Ａ逡逑組心臟移植物平均存活天數(shù)為５．７５±０．１０天，兩組具有統(tǒng)計(jì)．學(xué)差異（ｐ＜０．０１），提逡逑示ＴＬＲ２基因敲除可加速移植物排斥反應(yīng)。同系對照組（包括同系移植ＷＴ和逡逑ＴＬＲ２＿Ａ組）存活天數(shù)均大于３０天。逡逑

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本文編號：2814038