第一部分分枝桿菌中CRISPR干擾系統(tǒng)的建立目的:目前,進行結核分枝桿菌重要基因(尤其是必需基因)功能方面的研究受限于缺乏有效的技術工具定向刪除或失活結核分枝桿菌指定基因,無論是傳統(tǒng)的還是新興的基因編輯技術所引起的必需基因的敲除會直接造成細菌突變株不能成功制備,使得進行必需基因的功能研究無從談起。本研究以功能已知基因pkn B為靶基因,國內首次在恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis,Msm)中構建新型CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,成簇規(guī)律間隔短回文重復序列)干擾系統(tǒng),同時摸索如何提取高質量的且適合于進行分枝桿菌基因表達檢測的RNA,以及如何利用3':5'比率法定量檢測分枝桿菌RNA完整性。本研究構建的CRISPR干擾系統(tǒng)將來可為分枝桿菌重要基因的功能研究及結核病的防治奠定重要的技術理論基礎。方法:本研究應用的兩個載體為p RH2502載體(dcas9表達載體)(dead CRISPR-associated protein 9,dCas9,無活性CRISPR相關蛋白9)和p RH2521載體(sg RNA表達載體)(single-guide RNA,sg RNA,單鏈引導RNA),先將p RH2502載體電轉感受態(tài)的恥垢分枝桿菌,獲得可穩(wěn)定表達dcas9的菌株;再經(jīng)脫水四環(huán)素(anhydrotetracycline,a Tc)誘導培養(yǎng)12 h,提取和純化分枝桿菌RNA,檢測RNA的純度和完整性,確定獲得高質量分枝桿菌RNA的實驗方法;然后利用逆轉錄定量PCR(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)方法,進行3':5'比率法以檢測樣本RNA的完整性、進行連續(xù)稀釋雙標準曲線法以檢測樣本dcas9的表達;四環(huán)素誘導過程中繪制細菌的生長曲線,檢測過表達的dcas9對細菌生長的影響。另一個表達載體p RH2521經(jīng)酶切、去磷酸化和膠回收等步驟,靶基因pkn B特異性寡核苷酸單鏈經(jīng)化學合成、退火和磷酸化等步驟,二者再經(jīng)連接、轉化、測序驗證和質粒提取,以獲得表達靶基因pkn B特異性sg RNA的p RH2521表達載體。將靶基因特異性的p RH2521表達載體電轉到之前獲得的已穩(wěn)定表達dcas9的恥垢分枝桿菌;經(jīng)四環(huán)素誘導培養(yǎng)12 h,提取和純化分枝桿菌RNA,檢測RNA的純度和完整性;利用RT-q PCR方法,進行3':5'比率法以檢測樣本RNA的完整性、進行連續(xù)稀釋雙標準曲線法以檢測dcas9和靶基因pkn B的表達;四環(huán)素誘導過程中繪制細菌的生長曲線,檢測敲低的pkn B對細菌生長表型的影響。目的基因的相對表達量用平均值±標準差表示,使用Two-Way ANOVA(Prism 6.0,Graph Pad software)進行統(tǒng)計學分析。結果:(1)結果顯示,CRISPR干擾(CRISPRi,CRISPR interference)技術成功地誘導了恥垢分枝桿菌中dcas9的過表達,經(jīng)計算a Tc-12h組(四環(huán)素誘導12 h組)dcas9表達量約是N-a Tc-0h組(無四環(huán)素誘導0 h組)的271.4±75.3倍,差異具有統(tǒng)計學意義,且過表達的dcas9對細菌的生長沒有毒性作用;CRISPRi技術成功地敲低了靶基因pkn B,經(jīng)計算N-a Tc-0h組pkn B表達量約是a Tc-12h組的3.94±1.76倍,即靶基因pkn B被敲低了約74%,差異具有統(tǒng)計學意義,但在四環(huán)素誘導12 h時敲低的pkn B所引起的分枝桿菌生長表型上的變化并不明顯,可延長觀察時間以得到進一步的實驗結論。(2)本研究所提取的RNA,經(jīng)超微量紫外分光光度計測定,A260/280在1.8至2.0之間,樣本RNA溶液的純度好;經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測,23S片段的亮度是16S片段的2倍左右,RNA條帶銳利、無5S小片段彌散現(xiàn)象,樣本RNA的完整性較好。(3)經(jīng)3':5'比率法定量檢測樣本RNA的完整性,結果示各樣本的3':5'比率在1.1-3.6之間,樣本RNA的完整性較好。結論:(1)本研究在分枝桿菌中成功建立了CRISPR干擾系統(tǒng),包括成功誘導恥垢分枝桿菌中dcas9的過表達和成功敲低靶基因pkn B,該系統(tǒng)的建立為分枝桿菌重要/未知基因的功能研究奠定了重要的技術基礎。(2)本研究建立了獲取高質量且適合于進行分枝桿菌基因表達檢測的RNA的實驗方法,實驗證實使用含溶菌酶和蛋白酶K的TE緩沖溶液、利用熱Trizol法和機械破碎法、使用試劑盒純化RNA、進行痕量DNA的去除等都是提取和純化分枝桿菌中RNA的關鍵步驟。(3)本研究建立了3':5'比率法定量檢測分枝桿菌RNA完整性的實驗方法,該方法為后續(xù)基因表達定量檢測結果的科學性和可靠性提供了重要的實驗依據(jù)。第二部分CRISPR干擾系統(tǒng)在分枝桿菌重要基因功能研究中的應用目的:本研究是第一篇利用新型CRISPR干擾系統(tǒng)敲低恥垢分枝桿菌F基因并研究該基因功能的實驗研究。本研究首先利用CRISPR干擾系統(tǒng)敲低Msm_F基因,通過檢測敲低的Msm_F所引起的細菌生長表型和形態(tài)表型的變化,以揭示該基因作為必需基因在分枝桿菌中分化中所發(fā)揮的作用。其次,通過對脫靶基因表達水平的檢測,以驗證CRISPR干擾系統(tǒng)的低脫靶效應。再通過對兩個相互作用基因Msm_fts Z和Msm_mur G表達水平的檢測,以揭示Msm_F基因與細胞重要分化蛋白的編碼基因之間相互作用的機制。另外,在上述利用CRISPRi技術敲低Msm_F基因的過程中,確立一個簡單且操作性強的方法以實現(xiàn)CRISPRi靶向位點的有效選擇和sg RNA脫靶效應的預測評估。方法:本研究根據(jù)靶基因Msm_F編碼區(qū)靠近5'端所有PAM序列“5'-CCN-3'”(protospacer-adjacent motif,前間隔序列毗鄰基序)后面的20 nt序列,添加相應的酶切位點,設計可結合到靶基因編碼區(qū)正義鏈上的sg RNA,經(jīng)CAS OT軟件預測,入選了三條在恥垢分枝桿菌基因組中脫靶位點少的sg RNA,分別命名為Msm_F-1、Msm_F+46和Msm_F+101,將設計的兩條互補的寡核苷酸單鏈進行化學合成、退火和磷酸化,再與已線性化的酶切p RH2521表達載體進行連接、轉化、測序驗證和質粒提取等步驟,最后獲得3個分別靶向靶基因Msm_F三個位置的特異性sg RNA的p RH2521表達載體,同時還需設計一個不靶向分枝桿菌基因組內任何一個基因的對照sg RNA并進行相應p RH2521表達載體的構建。將3個靶基因特異性的p RH2521表達載體和一個sg RNA對照p RH2521表達載體分別電轉之前獲得的已穩(wěn)定表達dcas9的恥垢分枝桿菌;經(jīng)四環(huán)素誘導培養(yǎng),提取和純化分枝桿菌RNA,檢測RNA的純度和完整性;利用RT-q PCR的方法,進行3':5'比率法以檢測樣本RNA的完整性、進行連續(xù)稀釋雙標準曲線法以檢測dcas9、靶基因F、四個脫靶基因(MSMEG_6529、MSMEG_5505、MSMEG_1378和MSMEG_5373)和兩個相互作用基因(Msm_fts Z和Msm_mur G)的表達;四環(huán)素誘導過程中繪制細菌的生長曲線并觀察菌液狀態(tài),以檢測敲低的F對細菌生長表型的影響;四環(huán)素誘導12 h時鏡下觀察細胞形態(tài),以檢測敲低的F對細菌形態(tài)表型的影響。目的基因的相對表達量用平均值±標準差表示,使用Two-Way ANOVA(Prism 6.0,Graph Pad software)進行統(tǒng)計學分析。結果:(1)結果顯示,CRISPRi技術成功地誘導了恥垢分枝桿菌中dcas9的過表達和靶基因F的敲低,經(jīng)計算Msm_dcas9+F-1、Msm_dcas9+F+46和Msm_dcas9+F+101三種菌株a Tc-12h組dcas9表達量分別是N-a Tc-0h組的180.0±43.7、262.0±60.7和208.3±36.4倍,差異具有統(tǒng)計學意義,三種菌株N-a Tc-0h組F表達量分別是a Tc-12h組的60.7±11.9、18.8±1.7和38.3±8.3倍,即F基因分別被敲低了98%、95%和97%,差異具有統(tǒng)計學意義;而對照組Msm_dcas9+control菌則僅有dcas9表達的升高,沒有F的敲低。(2)結果顯示,敲低的Msm_F可以引起細菌生長表型和形態(tài)表型的變化,主要表現(xiàn)為在四環(huán)素誘導9 h時即出現(xiàn)的生長減慢現(xiàn)象和24 h時出現(xiàn)的細菌大量死亡的現(xiàn)象,以及在四環(huán)素誘導12 h時鏡下即可見菌體變長、呈絲狀化和產(chǎn)生分叉的現(xiàn)象,據(jù)肉眼直接估計a Tc組多數(shù)細菌的菌體長度最少增加了約2.5倍。(3)經(jīng)計算,與各菌株的N-a Tc-0h組相比,Msm_dcas9+F-1菌可能的脫靶基因MSMEG_6529、Msm_dcas9+F+46菌可能的脫靶基因MSMEG_5505以及Msm_dcas9+F+101菌可能的脫靶基因MSMEG_1378和MSMEG_5373在a Tc-12h組中的相對表達量分別為0.86±0.21、0.91±0.15、0.82±0.18和0.87±0.14,差異無統(tǒng)計學意義,即上述基因的表達均未受到脫靶效應的影響。(4)經(jīng)計算,在Msm_dcas9+F-1菌中,與N-a Tc-0h組相比,fts Z和mur G在a Tc-12h組中的相對表達量分別為0.93±0.09和0.96±0.09,差異無統(tǒng)計學意義,即敲低的F并未影響F相關基因——fts Z和mur G的表達。(5)另外,在上述利用CRISPRi技術敲低Msm_F基因的過程中,關于CRISPRi靶向位點的選擇,本研究經(jīng)實驗證實,所設計的3個sg RNA均十分有效地敲低了靶基因,有效率100%;關于sg RNA脫靶效應的預測評估,本研究發(fā)現(xiàn),CAS OT軟件可以在恥垢分枝桿菌中實現(xiàn)對sg RNA所靶向的潛在脫靶結合位點的有效搜尋。(6)本研究還首次利用一段土豆的序列(稱之為SPUD序列)設計實驗所需的對照sg RNA,經(jīng)CAS OT軟件分析發(fā)現(xiàn),設計的4條sg RNA與分枝桿菌全基因組≤5個不匹配堿基的脫靶位點數(shù)均為0-1個,該段序列適合用于不靶向分枝桿菌基因組內任何一個基因的對照sg RNA的設計。結論:(1)本研究首次應用新型CRISPRi技術在天然水平上成功敲低了恥垢分枝桿菌重要基因F。(2)本研究發(fā)現(xiàn)敲低的Msm_F可以引起細菌生長表型和形態(tài)表型的變化,本研究證實F作為恥垢分枝桿菌必需基因在細胞分化過程中發(fā)揮著重要的作用。(3)通過對四個脫靶基因的表達進行檢測,本研究證實CRISPRi技術具有較低的脫靶效應。(4)通過對兩個相互作用配體Msm_fts Z和Msm_mur G的表達進行檢測,本研究推測Msm_F的作用并不是通過影響兩個相互作用配體Msm_fts Z和Msm_mur G的表達水平來實現(xiàn)的,而是通過結構上的相互作用實現(xiàn)的。(5)另外,在上述利用CRISPRi技術敲低Msm_F基因的過程中,關于CRISPRi靶向位點的選擇,本研究建議,設計多個結合到靶基因正義鏈編碼區(qū)靠近5’端的sg RNA是一個簡單有效且操作性強的方法;關于sg RNA脫靶效應的預測評估,本研究認為,CAS OT軟件可以應用于恥垢分枝桿菌和其他一些沒有專業(yè)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站的細菌,該軟件可為研究者挑選低脫靶效應的sg RNA提供有效的預測依據(jù)。(6)本研究首次利用一段土豆的SPUD序列設計不靶向分枝桿菌基因組內任何一個基因的sg RNA,并經(jīng)CAS OT軟件分析證實該段序列確實與分枝桿菌(包括恥垢分枝桿菌和結核分枝桿菌)全基因組序列的同源性較差。
【學位單位】：北京市結核病胸部腫瘤研究所
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R378
【部分圖文】：

圖 1 CRISPR 介導的免疫系統(tǒng)[12]天然狀態(tài)下，CRISPR-Cas9 系統(tǒng)保護細菌和古生菌免受外來質�；虻拿庖哌^程分為三個階段（見圖 1）。獲取階段，細菌或古生菌通過PR-Cas9 系統(tǒng)識別首次入侵的 DNA 中的前間隔序列（proto-spacer） 序列（protospacer-adjacent motif，前間隔序列毗鄰基序），利用 Cas1將前間隔序列加工成為新的重復-間隔序列整合到 CRISPR 簇內。表達源基因再次入侵時，細菌轉錄重復-間隔序列形成 pre-crRNA（pre-CR），pre-crRNA 的重復序列與同時被轉錄的 tracrRNA（trans-activating C，反式激活 crRNA）互補結合形成雙鏈 RNA，在 Cas9 蛋白的協(xié)同下被ibonuclease III，核糖核酸酶 III）加工處理為成熟的 crRNA。干擾階A-tracrRNA-Cas9 蛋白復合體結合到與 crRNA 互補的靶基因上，Cas個結構域（RuvC 和 HNH）各剪切 DNA 雙鏈中的一條鏈，引入雙鏈之后宿主通過 HR（homologous recombination，同源重組）或 NHEJ

北京市結核病胸部腫瘤研究所博士學位論文erichia coli）靶基因的啟動子區(qū)或 ORF 區(qū)，通過阻止 RNAP（RNerase，RNA 聚合酶）與靶基因啟動子的結合干擾轉錄的起始或作為擾轉錄的延伸，研究者將該技術命名為CRISPRi技術（CRISPR inteR 干擾技術）（見圖 2）。該研究發(fā)現(xiàn)，dCas9 結合到啟動子區(qū)可以0 倍的基因表達抑制效果；dCas9 結合到編碼區(qū)也可抑制基因的表非模板鏈的效果要比模板鏈好；另外，可通過設計多個 sgRNA 的抑制多個基因或提高對同一基因抑制效果的目的。與 Cas9 蛋白相Ri 技術中的 dCas9 蛋白可同時抑制多個基因卻并不需要對基因進Cas9 在重要/未知基因尤其是必需基因的功能研究方面更具優(yōu)勢。

pRH2502載體圖譜

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 徐麗華;劉春雷;常玉梅;梁利群;劉金亮;高國強;韓啟霞;;雙標準曲線相對定量PCR試驗原理與方法[J];生物技術通報;2011年01期

本文編號：2813277