第一部分分枝桿菌中CRISPR干擾系統(tǒng)的建立目的:目前,進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌重要基因(尤其是必需基因)功能方面的研究受限于缺乏有效的技術(shù)工具定向刪除或失活結(jié)核分枝桿菌指定基因,無(wú)論是傳統(tǒng)的還是新興的基因編輯技術(shù)所引起的必需基因的敲除會(huì)直接造成細(xì)菌突變株不能成功制備,使得進(jìn)行必需基因的功能研究無(wú)從談起。本研究以功能已知基因pkn B為靶基因,國(guó)內(nèi)首次在恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis,Msm)中構(gòu)建新型CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列)干擾系統(tǒng),同時(shí)摸索如何提取高質(zhì)量的且適合于進(jìn)行分枝桿菌基因表達(dá)檢測(cè)的RNA,以及如何利用3':5'比率法定量檢測(cè)分枝桿菌RNA完整性。本研究構(gòu)建的CRISPR干擾系統(tǒng)將來(lái)可為分枝桿菌重要基因的功能研究及結(jié)核病的防治奠定重要的技術(shù)理論基礎(chǔ)。方法:本研究應(yīng)用的兩個(gè)載體為p RH2502載體(dcas9表達(dá)載體)(dead CRISPR-associated protein 9,dCas9,無(wú)活性CRISPR相關(guān)蛋白9)和p RH2521載體(sg RNA表達(dá)載體)(single-guide RNA,sg RNA,單鏈引導(dǎo)RNA),先將p RH2502載體電轉(zhuǎn)感受態(tài)的恥垢分枝桿菌,獲得可穩(wěn)定表達(dá)dcas9的菌株;再經(jīng)脫水四環(huán)素(anhydrotetracycline,a Tc)誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h,提取和純化分枝桿菌RNA,檢測(cè)RNA的純度和完整性,確定獲得高質(zhì)量分枝桿菌RNA的實(shí)驗(yàn)方法;然后利用逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)方法,進(jìn)行3':5'比率法以檢測(cè)樣本RNA的完整性、進(jìn)行連續(xù)稀釋雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法以檢測(cè)樣本dcas9的表達(dá);四環(huán)素誘導(dǎo)過(guò)程中繪制細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線,檢測(cè)過(guò)表達(dá)的dcas9對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。另一個(gè)表達(dá)載體p RH2521經(jīng)酶切、去磷酸化和膠回收等步驟,靶基因pkn B特異性寡核苷酸單鏈經(jīng)化學(xué)合成、退火和磷酸化等步驟,二者再經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序驗(yàn)證和質(zhì)粒提取,以獲得表達(dá)靶基因pkn B特異性sg RNA的p RH2521表達(dá)載體。將靶基因特異性的p RH2521表達(dá)載體電轉(zhuǎn)到之前獲得的已穩(wěn)定表達(dá)dcas9的恥垢分枝桿菌;經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h,提取和純化分枝桿菌RNA,檢測(cè)RNA的純度和完整性;利用RT-q PCR方法,進(jìn)行3':5'比率法以檢測(cè)樣本RNA的完整性、進(jìn)行連續(xù)稀釋雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法以檢測(cè)dcas9和靶基因pkn B的表達(dá);四環(huán)素誘導(dǎo)過(guò)程中繪制細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線,檢測(cè)敲低的pkn B對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)表型的影響。目的基因的相對(duì)表達(dá)量用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用Two-Way ANOVA(Prism 6.0,Graph Pad software)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:(1)結(jié)果顯示,CRISPR干擾(CRISPRi,CRISPR interference)技術(shù)成功地誘導(dǎo)了恥垢分枝桿菌中dcas9的過(guò)表達(dá),經(jīng)計(jì)算a Tc-12h組(四環(huán)素誘導(dǎo)12 h組)dcas9表達(dá)量約是N-a Tc-0h組(無(wú)四環(huán)素誘導(dǎo)0 h組)的271.4±75.3倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且過(guò)表達(dá)的dcas9對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)沒(méi)有毒性作用;CRISPRi技術(shù)成功地敲低了靶基因pkn B,經(jīng)計(jì)算N-a Tc-0h組pkn B表達(dá)量約是a Tc-12h組的3.94±1.76倍,即靶基因pkn B被敲低了約74%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但在四環(huán)素誘導(dǎo)12 h時(shí)敲低的pkn B所引起的分枝桿菌生長(zhǎng)表型上的變化并不明顯,可延長(zhǎng)觀察時(shí)間以得到進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。(2)本研究所提取的RNA,經(jīng)超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定,A260/280在1.8至2.0之間,樣本RNA溶液的純度好;經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè),23S片段的亮度是16S片段的2倍左右,RNA條帶銳利、無(wú)5S小片段彌散現(xiàn)象,樣本RNA的完整性較好。(3)經(jīng)3':5'比率法定量檢測(cè)樣本RNA的完整性,結(jié)果示各樣本的3':5'比率在1.1-3.6之間,樣本RNA的完整性較好。結(jié)論:(1)本研究在分枝桿菌中成功建立了CRISPR干擾系統(tǒng),包括成功誘導(dǎo)恥垢分枝桿菌中dcas9的過(guò)表達(dá)和成功敲低靶基因pkn B,該系統(tǒng)的建立為分枝桿菌重要/未知基因的功能研究奠定了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。(2)本研究建立了獲取高質(zhì)量且適合于進(jìn)行分枝桿菌基因表達(dá)檢測(cè)的RNA的實(shí)驗(yàn)方法,實(shí)驗(yàn)證實(shí)使用含溶菌酶和蛋白酶K的TE緩沖溶液、利用熱Trizol法和機(jī)械破碎法、使用試劑盒純化RNA、進(jìn)行痕量DNA的去除等都是提取和純化分枝桿菌中RNA的關(guān)鍵步驟。(3)本研究建立了3':5'比率法定量檢測(cè)分枝桿菌RNA完整性的實(shí)驗(yàn)方法,該方法為后續(xù)基因表達(dá)定量檢測(cè)結(jié)果的科學(xué)性和可靠性提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第二部分CRISPR干擾系統(tǒng)在分枝桿菌重要基因功能研究中的應(yīng)用目的:本研究是第一篇利用新型CRISPR干擾系統(tǒng)敲低恥垢分枝桿菌F基因并研究該基因功能的實(shí)驗(yàn)研究。本研究首先利用CRISPR干擾系統(tǒng)敲低Msm_F基因,通過(guò)檢測(cè)敲低的Msm_F所引起的細(xì)菌生長(zhǎng)表型和形態(tài)表型的變化,以揭示該基因作為必需基因在分枝桿菌中分化中所發(fā)揮的作用。其次,通過(guò)對(duì)脫靶基因表達(dá)水平的檢測(cè),以驗(yàn)證CRISPR干擾系統(tǒng)的低脫靶效應(yīng)。再通過(guò)對(duì)兩個(gè)相互作用基因Msm_fts Z和Msm_mur G表達(dá)水平的檢測(cè),以揭示Msm_F基因與細(xì)胞重要分化蛋白的編碼基因之間相互作用的機(jī)制。另外,在上述利用CRISPRi技術(shù)敲低Msm_F基因的過(guò)程中,確立一個(gè)簡(jiǎn)單且操作性強(qiáng)的方法以實(shí)現(xiàn)CRISPRi靶向位點(diǎn)的有效選擇和sg RNA脫靶效應(yīng)的預(yù)測(cè)評(píng)估。方法:本研究根據(jù)靶基因Msm_F編碼區(qū)靠近5'端所有PAM序列“5'-CCN-3'”(protospacer-adjacent motif,前間隔序列毗鄰基序)后面的20 nt序列,添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn),設(shè)計(jì)可結(jié)合到靶基因編碼區(qū)正義鏈上的sg RNA,經(jīng)CAS OT軟件預(yù)測(cè),入選了三條在恥垢分枝桿菌基因組中脫靶位點(diǎn)少的sg RNA,分別命名為Msm_F-1、Msm_F+46和Msm_F+101,將設(shè)計(jì)的兩條互補(bǔ)的寡核苷酸單鏈進(jìn)行化學(xué)合成、退火和磷酸化,再與已線性化的酶切p RH2521表達(dá)載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序驗(yàn)證和質(zhì)粒提取等步驟,最后獲得3個(gè)分別靶向靶基因Msm_F三個(gè)位置的特異性sg RNA的p RH2521表達(dá)載體,同時(shí)還需設(shè)計(jì)一個(gè)不靶向分枝桿菌基因組內(nèi)任何一個(gè)基因的對(duì)照sg RNA并進(jìn)行相應(yīng)p RH2521表達(dá)載體的構(gòu)建。將3個(gè)靶基因特異性的p RH2521表達(dá)載體和一個(gè)sg RNA對(duì)照p RH2521表達(dá)載體分別電轉(zhuǎn)之前獲得的已穩(wěn)定表達(dá)dcas9的恥垢分枝桿菌;經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)培養(yǎng),提取和純化分枝桿菌RNA,檢測(cè)RNA的純度和完整性;利用RT-q PCR的方法,進(jìn)行3':5'比率法以檢測(cè)樣本RNA的完整性、進(jìn)行連續(xù)稀釋雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法以檢測(cè)dcas9、靶基因F、四個(gè)脫靶基因(MSMEG_6529、MSMEG_5505、MSMEG_1378和MSMEG_5373)和兩個(gè)相互作用基因(Msm_fts Z和Msm_mur G)的表達(dá);四環(huán)素誘導(dǎo)過(guò)程中繪制細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線并觀察菌液狀態(tài),以檢測(cè)敲低的F對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)表型的影響;四環(huán)素誘導(dǎo)12 h時(shí)鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),以檢測(cè)敲低的F對(duì)細(xì)菌形態(tài)表型的影響。目的基因的相對(duì)表達(dá)量用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用Two-Way ANOVA(Prism 6.0,Graph Pad software)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:(1)結(jié)果顯示,CRISPRi技術(shù)成功地誘導(dǎo)了恥垢分枝桿菌中dcas9的過(guò)表達(dá)和靶基因F的敲低,經(jīng)計(jì)算Msm_dcas9+F-1、Msm_dcas9+F+46和Msm_dcas9+F+101三種菌株a Tc-12h組dcas9表達(dá)量分別是N-a Tc-0h組的180.0±43.7、262.0±60.7和208.3±36.4倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,三種菌株N-a Tc-0h組F表達(dá)量分別是a Tc-12h組的60.7±11.9、18.8±1.7和38.3±8.3倍,即F基因分別被敲低了98%、95%和97%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而對(duì)照組Msm_dcas9+control菌則僅有dcas9表達(dá)的升高,沒(méi)有F的敲低。(2)結(jié)果顯示,敲低的Msm_F可以引起細(xì)菌生長(zhǎng)表型和形態(tài)表型的變化,主要表現(xiàn)為在四環(huán)素誘導(dǎo)9 h時(shí)即出現(xiàn)的生長(zhǎng)減慢現(xiàn)象和24 h時(shí)出現(xiàn)的細(xì)菌大量死亡的現(xiàn)象,以及在四環(huán)素誘導(dǎo)12 h時(shí)鏡下即可見(jiàn)菌體變長(zhǎng)、呈絲狀化和產(chǎn)生分叉的現(xiàn)象,據(jù)肉眼直接估計(jì)a Tc組多數(shù)細(xì)菌的菌體長(zhǎng)度最少增加了約2.5倍。(3)經(jīng)計(jì)算,與各菌株的N-a Tc-0h組相比,Msm_dcas9+F-1菌可能的脫靶基因MSMEG_6529、Msm_dcas9+F+46菌可能的脫靶基因MSMEG_5505以及Msm_dcas9+F+101菌可能的脫靶基因MSMEG_1378和MSMEG_5373在a Tc-12h組中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.86±0.21、0.91±0.15、0.82±0.18和0.87±0.14,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即上述基因的表達(dá)均未受到脫靶效應(yīng)的影響。(4)經(jīng)計(jì)算,在Msm_dcas9+F-1菌中,與N-a Tc-0h組相比,fts Z和mur G在a Tc-12h組中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.93±0.09和0.96±0.09,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即敲低的F并未影響F相關(guān)基因——fts Z和mur G的表達(dá)。(5)另外,在上述利用CRISPRi技術(shù)敲低Msm_F基因的過(guò)程中,關(guān)于CRISPRi靶向位點(diǎn)的選擇,本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),所設(shè)計(jì)的3個(gè)sg RNA均十分有效地敲低了靶基因,有效率100%;關(guān)于sg RNA脫靶效應(yīng)的預(yù)測(cè)評(píng)估,本研究發(fā)現(xiàn),CAS OT軟件可以在恥垢分枝桿菌中實(shí)現(xiàn)對(duì)sg RNA所靶向的潛在脫靶結(jié)合位點(diǎn)的有效搜尋。(6)本研究還首次利用一段土豆的序列(稱之為SPUD序列)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)所需的對(duì)照sg RNA,經(jīng)CAS OT軟件分析發(fā)現(xiàn),設(shè)計(jì)的4條sg RNA與分枝桿菌全基因組≤5個(gè)不匹配堿基的脫靶位點(diǎn)數(shù)均為0-1個(gè),該段序列適合用于不靶向分枝桿菌基因組內(nèi)任何一個(gè)基因的對(duì)照sg RNA的設(shè)計(jì)。結(jié)論:(1)本研究首次應(yīng)用新型CRISPRi技術(shù)在天然水平上成功敲低了恥垢分枝桿菌重要基因F。(2)本研究發(fā)現(xiàn)敲低的Msm_F可以引起細(xì)菌生長(zhǎng)表型和形態(tài)表型的變化,本研究證實(shí)F作為恥垢分枝桿菌必需基因在細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。(3)通過(guò)對(duì)四個(gè)脫靶基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),本研究證實(shí)CRISPRi技術(shù)具有較低的脫靶效應(yīng)。(4)通過(guò)對(duì)兩個(gè)相互作用配體Msm_fts Z和Msm_mur G的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),本研究推測(cè)Msm_F的作用并不是通過(guò)影響兩個(gè)相互作用配體Msm_fts Z和Msm_mur G的表達(dá)水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的,而是通過(guò)結(jié)構(gòu)上的相互作用實(shí)現(xiàn)的。(5)另外,在上述利用CRISPRi技術(shù)敲低Msm_F基因的過(guò)程中,關(guān)于CRISPRi靶向位點(diǎn)的選擇,本研究建議,設(shè)計(jì)多個(gè)結(jié)合到靶基因正義鏈編碼區(qū)靠近5’端的sg RNA是一個(gè)簡(jiǎn)單有效且操作性強(qiáng)的方法;關(guān)于sg RNA脫靶效應(yīng)的預(yù)測(cè)評(píng)估,本研究認(rèn)為,CAS OT軟件可以應(yīng)用于恥垢分枝桿菌和其他一些沒(méi)有專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站的細(xì)菌,該軟件可為研究者挑選低脫靶效應(yīng)的sg RNA提供有效的預(yù)測(cè)依據(jù)。(6)本研究首次利用一段土豆的SPUD序列設(shè)計(jì)不靶向分枝桿菌基因組內(nèi)任何一個(gè)基因的sg RNA,并經(jīng)CAS OT軟件分析證實(shí)該段序列確實(shí)與分枝桿菌(包括恥垢分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌)全基因組序列的同源性較差。
【學(xué)位單位】：北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R378
【部分圖文】：

圖 1 CRISPR 介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)[12]天然狀態(tài)下，CRISPR-Cas9 系統(tǒng)保護(hù)細(xì)菌和古生菌免受外來(lái)質(zhì)粒或的免疫過(guò)程分為三個(gè)階段（見(jiàn)圖 1）。獲取階段，細(xì)菌或古生菌通過(guò)PR-Cas9 系統(tǒng)識(shí)別首次入侵的 DNA 中的前間隔序列（proto-spacer） 序列（protospacer-adjacent motif，前間隔序列毗鄰基序），利用 Cas1將前間隔序列加工成為新的重復(fù)-間隔序列整合到 CRISPR 簇內(nèi)。表達(dá)源基因再次入侵時(shí)，細(xì)菌轉(zhuǎn)錄重復(fù)-間隔序列形成 pre-crRNA（pre-CR），pre-crRNA 的重復(fù)序列與同時(shí)被轉(zhuǎn)錄的 tracrRNA（trans-activating C，反式激活 crRNA）互補(bǔ)結(jié)合形成雙鏈 RNA，在 Cas9 蛋白的協(xié)同下被ibonuclease III，核糖核酸酶 III）加工處理為成熟的 crRNA。干擾階A-tracrRNA-Cas9 蛋白復(fù)合體結(jié)合到與 crRNA 互補(bǔ)的靶基因上，Cas個(gè)結(jié)構(gòu)域（RuvC 和 HNH）各剪切 DNA 雙鏈中的一條鏈，引入雙鏈之后宿主通過(guò) HR（homologous recombination，同源重組）或 NHEJ

北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所博士學(xué)位論文erichia coli）靶基因的啟動(dòng)子區(qū)或 ORF 區(qū)，通過(guò)阻止 RNAP（RNerase，RNA 聚合酶）與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合干擾轉(zhuǎn)錄的起始或作為擾轉(zhuǎn)錄的延伸，研究者將該技術(shù)命名為CRISPRi技術(shù)（CRISPR inteR 干擾技術(shù)）（見(jiàn)圖 2）。該研究發(fā)現(xiàn)，dCas9 結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)可以0 倍的基因表達(dá)抑制效果；dCas9 結(jié)合到編碼區(qū)也可抑制基因的表非模板鏈的效果要比模板鏈好；另外，可通過(guò)設(shè)計(jì)多個(gè) sgRNA 的抑制多個(gè)基因或提高對(duì)同一基因抑制效果的目的。與 Cas9 蛋白相Ri 技術(shù)中的 dCas9 蛋白可同時(shí)抑制多個(gè)基因卻并不需要對(duì)基因進(jìn)Cas9 在重要/未知基因尤其是必需基因的功能研究方面更具優(yōu)勢(shì)。

pRH2502載體圖譜

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 徐麗華;劉春雷;常玉梅;梁利群;劉金亮;高國(guó)強(qiáng);韓啟霞;;雙標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量PCR試驗(yàn)原理與方法[J];生物技術(shù)通報(bào);2011年01期

本文編號(hào)：2813277