低血磷性佝僂病(Hypophosphatemic Rickets,HR)是由腎臟中磷酸鹽的丟失導(dǎo)致血磷降低,最終引起骨骼礦化異常的一類骨疾病。常染色體隱性遺傳低血磷性佝僂病(Autosomal Recessive Hypophosphatemic Rickets,ARHR)是其中的一種,主要表現(xiàn)為佝僂病和骨軟化癥等,同時(shí)伴有身材矮小,骨骼及牙齒發(fā)育異常,血清FGF23水平升高,血磷降低等臨床癥狀。ARHR的主要致病基因?yàn)镈MP1(Dentin Matrix Protein 1)基因,位于人染色體4q21-22,含有7個(gè)外顯子,編碼一種在骨骼和牙齒中高表達(dá)的酸性非膠原蛋白,在骨和牙齒的形成和礦化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。DMP1通過(guò)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23(FGF23),一種由骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞合成的具有內(nèi)分泌功能的蛋白質(zhì),調(diào)節(jié)體內(nèi)磷酸酶的穩(wěn)態(tài),加速磷酸鹽代謝,進(jìn)而調(diào)節(jié)血磷水平。因此,對(duì)DMP1的研究有助于提高人們對(duì)骨骼礦化、腎臟中磷轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的認(rèn)識(shí),進(jìn)而揭示ARHR的發(fā)病機(jī)理。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人們迫切希望對(duì)疾病有更深刻的了解。研究發(fā)現(xiàn),疾病的發(fā)生與基因突變密切相關(guān)。但由于臨床表現(xiàn)的復(fù)雜性,疾病的發(fā)病機(jī)理尚不明確,因而缺少有效的預(yù)防和治療措施。因此,建立模擬人類疾病的動(dòng)物模型對(duì)于疾病發(fā)病機(jī)理的研究以及治療方法的篩選至關(guān)重要。目前,研究人員已經(jīng)成功建立了小鼠的ARHR模型。但是由于小鼠骨組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和關(guān)節(jié)炎的病理變化與人類存在差異,不能完全模擬人類ARHR疾病。而兔作為一種經(jīng)典的模式動(dòng)物,它的生理結(jié)構(gòu)與人類更為相似,同時(shí)還具有飼養(yǎng)費(fèi)用低、妊娠周期短等優(yōu)點(diǎn),是一種模擬人類疾病的更為可靠的、理想的模式動(dòng)物。本研究中,我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)兔DMP1基因進(jìn)行編輯,成功獲得了DMP1基因敲除兔,并且經(jīng)過(guò)檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。對(duì)DMP1基因敲除兔表型鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn):DMP1基因敲除兔調(diào)磷基因表達(dá)異常,血清中FGF23升高、血磷降低。牙齒,下頜體,長(zhǎng)骨等多處骨骼礦化不全,骨密度降低。肋骨和椎骨具有佝僂病典型癥狀,出現(xiàn)“串珠狀”結(jié)節(jié)。長(zhǎng)骨發(fā)育異常,骨細(xì)胞突變,造成長(zhǎng)骨變短變粗。這些表型與人類ARHR患者的臨床表現(xiàn)相一致。兔ARHR模型的建立有助于揭示人類ARHR的發(fā)病機(jī)理,同時(shí)為ARHR的藥物篩選和臨床治療提供理想的動(dòng)物模型。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R-332;R591.44
【部分圖文】：

甲狀旁腺激素調(diào)節(jié)磷酸鹽[54]

1.2.8 T7EI 實(shí)驗(yàn)分析T7EI 實(shí)驗(yàn)分析，利用瓊脂糖電泳對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析鑒定，方法如下：取 8 μLPCR 產(chǎn)物，向其中加入 2 μL NEBuffer2，放入 PCR 中，95℃10 分鐘，放入室溫中自然降溫，然后加入 T7EI 0.5 μL，在 37℃條件下 30 分鐘后可鑒定。1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.3.1 兔 DMP1 sgRNA 敲除靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)在 NCBI 中，依照 GeneBank 上兔 DMP1 基因序列，分別在第一個(gè)和第二個(gè)外顯子上分別設(shè)計(jì)打靶位點(diǎn)，圖 1.1。其中藍(lán)色矩形框表示 DMP1 基因的外顯子，紅色代表兩個(gè) sgRNA 的靶位點(diǎn)，藍(lán)色代表 PAM 區(qū)。

24圖 1.2 T 載體克隆基因組測(cè)序 DMP1 敲除兔基因型Fig. 1.2 Tvector cloning genome sequencing of DMP1 KO rabbit1.3.4 脫靶實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析為檢測(cè) DMP1 基因敲除兔中是否有脫靶效應(yīng)，根據(jù)上述設(shè)計(jì)的 5 對(duì)引物，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增及 T7EI 酶切實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖 1.3。PCR 產(chǎn)物鑒定及 T7EI 酶切結(jié)果顯示沒(méi)有脫靶現(xiàn)象。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 隋婷婷;兔X-連鎖低血磷性佝僂病模型的建立[D];吉林大學(xué);2016年

本文編號(hào)：2811307