低血磷性佝僂病(Hypophosphatemic Rickets,HR)是由腎臟中磷酸鹽的丟失導(dǎo)致血磷降低,最終引起骨骼礦化異常的一類骨疾病。常染色體隱性遺傳低血磷性佝僂病(Autosomal Recessive Hypophosphatemic Rickets,ARHR)是其中的一種,主要表現(xiàn)為佝僂病和骨軟化癥等,同時伴有身材矮小,骨骼及牙齒發(fā)育異常,血清FGF23水平升高,血磷降低等臨床癥狀。ARHR的主要致病基因為DMP1(Dentin Matrix Protein 1)基因,位于人染色體4q21-22,含有7個外顯子,編碼一種在骨骼和牙齒中高表達的酸性非膠原蛋白,在骨和牙齒的形成和礦化過程中發(fā)揮重要作用。DMP1通過成纖維細胞生長因子23(FGF23),一種由骨細胞和成骨細胞合成的具有內(nèi)分泌功能的蛋白質(zhì),調(diào)節(jié)體內(nèi)磷酸酶的穩(wěn)態(tài),加速磷酸鹽代謝,進而調(diào)節(jié)血磷水平。因此,對DMP1的研究有助于提高人們對骨骼礦化、腎臟中磷轉(zhuǎn)運機制的認識,進而揭示ARHR的發(fā)病機理。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人們迫切希望對疾病有更深刻的了解。研究發(fā)現(xiàn),疾病的發(fā)生與基因突變密切相關(guān)。但由于臨床表現(xiàn)的復(fù)雜性,疾病的發(fā)病機理尚不明確,因而缺少有效的預(yù)防和治療措施。因此,建立模擬人類疾病的動物模型對于疾病發(fā)病機理的研究以及治療方法的篩選至關(guān)重要。目前,研究人員已經(jīng)成功建立了小鼠的ARHR模型。但是由于小鼠骨組織形態(tài)學(xué)特點和關(guān)節(jié)炎的病理變化與人類存在差異,不能完全模擬人類ARHR疾病。而兔作為一種經(jīng)典的模式動物,它的生理結(jié)構(gòu)與人類更為相似,同時還具有飼養(yǎng)費用低、妊娠周期短等優(yōu)點,是一種模擬人類疾病的更為可靠的、理想的模式動物。本研究中,我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)對兔DMP1基因進行編輯,成功獲得了DMP1基因敲除兔,并且經(jīng)過檢測未發(fā)現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。對DMP1基因敲除兔表型鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn):DMP1基因敲除兔調(diào)磷基因表達異常,血清中FGF23升高、血磷降低。牙齒,下頜體,長骨等多處骨骼礦化不全,骨密度降低。肋骨和椎骨具有佝僂病典型癥狀,出現(xiàn)“串珠狀”結(jié)節(jié)。長骨發(fā)育異常,骨細胞突變,造成長骨變短變粗。這些表型與人類ARHR患者的臨床表現(xiàn)相一致。兔ARHR模型的建立有助于揭示人類ARHR的發(fā)病機理,同時為ARHR的藥物篩選和臨床治療提供理想的動物模型。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R-332;R591.44
【部分圖文】：

甲狀旁腺激素調(diào)節(jié)磷酸鹽[54]

1.2.8 T7EI 實驗分析T7EI 實驗分析，利用瓊脂糖電泳對結(jié)果進行分析鑒定，方法如下：取 8 μLPCR 產(chǎn)物，向其中加入 2 μL NEBuffer2，放入 PCR 中，95℃10 分鐘，放入室溫中自然降溫，然后加入 T7EI 0.5 μL，在 37℃條件下 30 分鐘后可鑒定。1.3 實驗結(jié)果1.3.1 兔 DMP1 sgRNA 敲除靶位點設(shè)計在 NCBI 中，依照 GeneBank 上兔 DMP1 基因序列，分別在第一個和第二個外顯子上分別設(shè)計打靶位點，圖 1.1。其中藍色矩形框表示 DMP1 基因的外顯子，紅色代表兩個 sgRNA 的靶位點，藍色代表 PAM 區(qū)。

24圖 1.2 T 載體克隆基因組測序 DMP1 敲除兔基因型Fig. 1.2 Tvector cloning genome sequencing of DMP1 KO rabbit1.3.4 脫靶實驗結(jié)果分析為檢測 DMP1 基因敲除兔中是否有脫靶效應(yīng)，根據(jù)上述設(shè)計的 5 對引物，進行 PCR 擴增及 T7EI 酶切實驗。結(jié)果如圖 1.3。PCR 產(chǎn)物鑒定及 T7EI 酶切結(jié)果顯示沒有脫靶現(xiàn)象。

【參考文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 隋婷婷;兔X-連鎖低血磷性佝僂病模型的建立[D];吉林大學(xué);2016年

本文編號：2811307