【背景】研究發(fā)現(xiàn),HCMV在感染早期可短暫激活細胞自噬,隨后抑制自噬。HCMV與細胞自噬相互作用可調(diào)控病毒復(fù)制水平。然而,HCMV調(diào)控自噬的具體分子機制尚不明確。本課題組前期研究中,利用酵母雙雜交技術(shù)檢測到MCMV的M122蛋白與自噬的重要調(diào)節(jié)分子—自噬相關(guān)蛋白3(Atg3)存在相互作用。我們推測,HCMV也可能通過其蛋白IE86(與MCMV-M122同源)與Atg3相互作用而調(diào)控細胞自噬�！灸康摹繖z驗HCMV IE86蛋白與人Atg3蛋白是否存在相互作用,為HCMV IE86蛋白的功能研究提供實驗依據(jù)和線索�！痉椒ā�1.目的基因克隆載體構(gòu)建:根據(jù)目的基因UL122和ATG3蛋白質(zhì)編碼序列設(shè)計PCR引物,RT-PCR法擴增相應(yīng)目的片段并電泳回收,利用TA克隆技術(shù)將目的基因分別插入到pMD18T質(zhì)粒中,構(gòu)建pMD18T-UL122和pMD18T-ATG3重組克隆載體,雙酶切及測序鑒定;2.目的基因表達載體構(gòu)建:以pMD18T-UL122和pMD18T-ATG3為模板,PCR擴增目的基因并電泳回收;雙酶切pc DNA3.1質(zhì)粒并電泳回收;利用In-fusion技術(shù)將目的片段分別插入到pc DNA3.1質(zhì)粒中,構(gòu)建pc DNA3.1-UL122和pc DNA3.1-ATG3重組表達載體,雙酶切及測序鑒定;3.目的蛋白的表達:提取無內(nèi)毒素的pc DNA3.1-UL122和pc DNA3.1-ATG3質(zhì)粒,利用lipo3000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中,提取蛋白后,應(yīng)用Western Blotting檢測目的蛋白的表達;4.免疫共沉淀驗證蛋白相互作用:目的基因在HEK293T中表達后,提取蛋白,應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)檢測IE86與Atg3是否存在相互作用�！窘Y(jié)果】1.成功構(gòu)建pMD18T-UL122和pMD18T-ATG3重組克隆載體,雙酶切及測序鑒定無誤;2.成功構(gòu)建pc DNA3.1-UL122和pc DNA3.1-ATG3重組表達載體,雙酶切及測序鑒定無誤;3.pc DNA3.1-UL122和pc DNA3.1-ATG3可在HEK293T細胞中分別成功表達IE86和Atg3蛋白;4.免疫共沉淀技術(shù)未能證實IE86與Atg3存在相互作用。【結(jié)論】1.成功構(gòu)建了用于哺乳細胞表達的pc DNA3.1-UL122和pc DNA3.1-ATG3重組表達載體,并在HEK293T中成功表達IE86和Atg3蛋白,為相關(guān)蛋白的功能研究奠定基礎(chǔ);2.IE86與Atg3可能不存在相互作用,HCMV可能通過其他機制調(diào)控自噬。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R373
【部分圖文】：

25圖 1 PCR 產(chǎn)物電泳圖酶切鑒定 BamH I 和 EcoR I 分步雙酶切重組質(zhì)粒物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖 2條帶在 2000bp～3000bp 之間，與載體 pM 1500bp～2000bp 之間，與目的基因 UL1在 2000bp～3000bp 之間，與載體 pMD18 1000bp，與目的基因 ATG3（945bp）大小

圖 2 重組克隆載體雙酶切產(chǎn)物電泳圖122 酶切產(chǎn)物電泳圖；2：pMD18T-ATG3 酶切測序鑒定正確的質(zhì)粒送測序，測序結(jié)果經(jīng)過 BLAST 基序列與目的片段完全符合，插入位置正確

pMD18T-UL122正向測序圖，其中第60位為插入起始位點

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本文編號：2812405