探索生命的奧秘,揭開生老病死的神秘面紗一直是人類在生命科學(xué)領(lǐng)域的偉大愿景。深入研究蛋白質(zhì)之間的相互作用、搭建蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)是直接闡明生理或者病理?xiàng)l件下各種生物學(xué)活動(dòng)的重要一環(huán)。目前,研究蛋白質(zhì)相互作用的方法主要包括免疫共沉淀、GST Pull-down、酵母雙雜交技術(shù)、表面等離子共振技術(shù)等。雖然這些方法可以滿足大多數(shù)科研要求,但一定程度上存在各自的不足,不利于經(jīng)濟(jì)高效地檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用。談及經(jīng)濟(jì)高效的檢測方法,免疫分析技術(shù)是目前應(yīng)用最廣的方法。其中光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)(AlphaLISA)作為一種新型的均相免疫分析技術(shù)具有高靈敏度、高通量、無需洗滌等優(yōu)點(diǎn)。本課題旨在探索AlphaLISA技術(shù)在快速檢測蛋白質(zhì)相互作用上的應(yīng)用,建立新型的研究蛋白質(zhì)之間相互作用的方法。本研究以p53蛋白為例,嘗試建立快速檢測它與相關(guān)蛋白之間相互作用的方法。因?yàn)閜53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因,而且目前其相關(guān)研究論文多達(dá)8000余篇,相互作用網(wǎng)絡(luò)相對(duì)完整。本研究內(nèi)容主要分為幾部分:實(shí)驗(yàn)原材料的制備,包括p53和相互作用蛋白的表達(dá)以及相互作用情況的驗(yàn)證,尤其是篩選檢測所需的特異性抗體;采用雙抗體夾心法,探索光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢測細(xì)胞裂解液中靶分子的可行性;采用競爭法,利用光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢測p53蛋白與相關(guān)蛋白質(zhì)之間的相互作用;探索光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在新藥篩選中的應(yīng)用,建立高通量篩選p53-MDM2抑制劑的免疫分析方法。結(jié)果如下:(1)成功構(gòu)建p53、MDM2、MDM4及其它相關(guān)的表達(dá)質(zhì)粒,并利用GST pull-down技術(shù)驗(yàn)證p53與MDM2、MDM4等的相互作用;(2)篩選到了與MDM2競爭性結(jié)合p53的單克隆抗體株;(3)成功制備了尺寸、懸浮性質(zhì)優(yōu)異的偶聯(lián)了 p53抗體的發(fā)光微球;(4)成功建立了基于AlphaLISA技術(shù)快速檢測細(xì)胞裂解液中p53-his融合蛋白的方法,摸索出了最優(yōu)的反應(yīng)時(shí)間以及各組分的最優(yōu)濃度,繪制了劑量-效應(yīng)曲線;(5)采用競爭法模式成功檢測到p53與MDM2和MDM4的相互作用,可見隨著MDM2/MDM4蛋白增加,體系中游離的p53逐漸減少,檢測信號(hào)值隨之下降;另外該方法可用于高通量快速篩選p53的負(fù)調(diào)控蛋白;(6)成功建立了高通量篩選p53-MDM2抑制劑的AlphaLISA方法,6種已知的抑制劑均能被該方法有效檢測到,并且具有很好的特異性;(7)成功真核表達(dá)p53相互作用蛋白共計(jì)15個(gè),并利用GST pull-down技術(shù)驗(yàn)證其與p53蛋白之間的相互作用。本研究創(chuàng)新性地將免疫分析技術(shù)與蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行有機(jī)結(jié)合,建立了經(jīng)濟(jì)高效地檢測蛋白質(zhì)之間相互作用的新型分析方法,并成功將這一方法應(yīng)用到了新藥研發(fā)中,極具開發(fā)前景。該方法相較于現(xiàn)有的研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)方法具有所需待測樣品少、待研究蛋白無需純化、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)短、易于高通量等優(yōu)點(diǎn),為今后實(shí)現(xiàn)快速、經(jīng)濟(jì)、自動(dòng)化以及高通量地檢測蛋白質(zhì)之間相互作用、篩選新的藥物前體提供了科學(xué)依據(jù),相信其具有廣闊的應(yīng)用前景。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392-33
【部分圖文】：

光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)根據(jù)發(fā)光物質(zhì)不同又可分為ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ和逡逑ｌｐｈａＬＩＳＡ技術(shù)。在ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ分析法中這一發(fā)光物質(zhì)為紅熒q媯旆倭兜姆㈠義喜ㄆ綴蕓恚⑸涑魴藕挪ǔし段擔(dān)玻埃叮玻埃睿�，因此栽傡矎T藕攀北匭胍褂緬義瞎餛聰し⒐庠吹母扇擰６液煊┦粲謨謝玖�，化学袨�(zāi)什晃榷�，容辶x弦妝湫蔚賈路治黿峁榷ㄐ圓�。后来Ｐｅ}耄椋睿牛歟恚澹蜆駒冢粒歟穡瑁幔櫻悖潁澹澹罘治齜ǖ膩義洗≈峽⒘隋澹粒歟穡瑁幔蹋桑櫻良際酰捎孟⊥獵仡穡ǎ牛酰├刺媧吹姆⒐馕镥義蝦煊鸕姆⑸洳ǔし淺＜餿裎叮保擔(dān)睿恚郟擔(dān)罰擔(dān)福蕁６業(yè)靡嬗詬泄馕⑶蠔頭⒐忮義锨虻牧＞對(duì)嘉玻埃埃睿懟⒈礱婢似暇厶腔肀苊飭宋⑶虻姆翹匾煨躍奐�、辶x霞由戲從μ逑抵形⑶蚺ǘ群艿拖嗷ニ婊鱟駁募嘎屎萇伲粒歟穡瑁幔蹋桑櫻良際醣鏡族義系�，蠟�(zāi)岣吡誦旁氡�。辶x希瑰義

本文編號(hào)：2809296