【摘要】：目的:建立果蠅與小鼠機(jī)械創(chuàng)傷模型;探討腸道微生物在機(jī)械性創(chuàng)傷病理過(guò)程中作用及潛在的機(jī)理。方法:1.以黑腹果蠅為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用自由落體方法建立機(jī)械性創(chuàng)傷模型,通過(guò)24小時(shí)死亡指數(shù)評(píng)價(jià)機(jī)械性創(chuàng)傷的結(jié)果;以C57BL6雄性小鼠為自由落體創(chuàng)傷模型,對(duì)照組20只,實(shí)驗(yàn)組20只,分別測(cè)定機(jī)械性創(chuàng)傷后24 h和48 h小鼠的存活率。2.以CR果蠅為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定裝置,測(cè)定機(jī)械性創(chuàng)傷后果蠅的運(yùn)動(dòng)能力;以C57BL6雄性小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,對(duì)照組5只,實(shí)驗(yàn)組20只,分別測(cè)定對(duì)照組、機(jī)械性創(chuàng)傷后瞬間、機(jī)械性創(chuàng)傷后20 min和40 min小鼠的奔跑速度和攀爬頻率。3.以C57BL6雄性小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,對(duì)照組5只,實(shí)驗(yàn)組20只,機(jī)械性創(chuàng)傷后,分別對(duì)對(duì)照組、機(jī)械性創(chuàng)傷后24 h與機(jī)械性創(chuàng)傷后48 h結(jié)腸組織取樣,并用Image J軟件對(duì)其結(jié)腸組織的長(zhǎng)度和寬度測(cè)量。4.以CR、GF、OAC和E.coli果蠅為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,各分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,機(jī)械性創(chuàng)傷后,采用濃度梯度稀釋涂板法檢測(cè)各組果蠅腸道載菌量;以C57BL6雄性小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,對(duì)照組5只,實(shí)驗(yàn)組20只,分別對(duì)對(duì)照組、機(jī)械性創(chuàng)傷后24 h與機(jī)械性創(chuàng)傷后48 h結(jié)腸組織取樣,每組5個(gè)組織樣品,液氮速凍,干冰低溫保存,16S rDNA測(cè)序。5.以CR、GF、OAC和E.coli果蠅為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,測(cè)定機(jī)械性創(chuàng)傷后24小時(shí)果蠅死亡指數(shù)。6.以CR、GF、OAC和E.coli果蠅為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,各分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,機(jī)械性創(chuàng)傷后,采用染料滲透性試驗(yàn)檢測(cè)機(jī)械性創(chuàng)傷后腸道屏障功能。7.以CR、GF、OAC和E.coli果蠅為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,機(jī)械性創(chuàng)傷后,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)每組果蠅體內(nèi)Attacin-C、Diptericin B基因的表達(dá)水平;以C57BL6雄性小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,機(jī)械性創(chuàng)傷后,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中炎性細(xì)胞因子TNF-α、lL-6、lL-10和緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的表達(dá)水平。8.以CR果蠅為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,機(jī)械性創(chuàng)傷后分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組用5%蔗糖處理,實(shí)驗(yàn)組用混合抗生素處理,24小時(shí)后分別測(cè)定死亡指數(shù)、運(yùn)動(dòng)能力、SI_(24)百分率、腸道載菌量和免疫基因Attacin-C和Diptericin B基因的表達(dá)水平等指標(biāo)。結(jié)果:1.建立自由落體創(chuàng)傷模型,該模型具有代表性強(qiáng),操作簡(jiǎn)單易行,可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。2.自由落體創(chuàng)傷增加黑腹果蠅死亡率,死亡指數(shù)隨著自由落體高度和機(jī)械性創(chuàng)傷次數(shù)的增加而增加,與對(duì)照組相比,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001)。優(yōu)化出以15 m為自由落體機(jī)械性創(chuàng)傷模型的高度。小鼠機(jī)械性創(chuàng)傷后24 h和48 h存活率分別為85%和75%。3.機(jī)械性創(chuàng)傷降低創(chuàng)傷模型的運(yùn)動(dòng)能力。結(jié)果顯示CR果蠅機(jī)械性創(chuàng)傷后奔跑速度和攀爬速度下降(P0.01,P0.001)。C57BL6雄性小鼠在機(jī)械創(chuàng)傷后瞬間、機(jī)械創(chuàng)傷后20 min和40 min,奔跑速度和攀爬頻率下降(P0.01,P0.01,P0.01);小鼠在機(jī)械性創(chuàng)傷后的瞬間攀爬的頻率為0,機(jī)械性創(chuàng)傷后20 min和40 min,攀爬頻率與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001,P0.001)。3.C57BL6雄性小鼠對(duì)照組、機(jī)械性創(chuàng)傷后24 h與48 h結(jié)腸組織寬度測(cè)定顯示:隨著機(jī)械性創(chuàng)傷后時(shí)間的延長(zhǎng),結(jié)腸組織寬度增加(P0.05,P0.001),結(jié)腸組織長(zhǎng)度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4.16S rDNA測(cè)序顯示:厚壁菌豐富度在機(jī)械性創(chuàng)傷后的24 h內(nèi)增加(P0.05),而在之后的48 h內(nèi)降低,但仍高于對(duì)照組;擬桿菌豐富度在機(jī)械性創(chuàng)傷后的24 h內(nèi)降低(P0.05),48 h內(nèi)比創(chuàng)傷后24 h時(shí)豐富度增加,但仍低于對(duì)照組;疣微菌群豐富度在機(jī)械創(chuàng)傷后的24 h達(dá)到最高水平(P0.05);放線(xiàn)菌的菌群豐富度并無(wú)很大的變化;變形菌的菌群豐富度在機(jī)械創(chuàng)傷后24 h和48 h呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。PCA分析顯示對(duì)照組、機(jī)械性創(chuàng)傷24 h和48 h的菌種群落分布具有較大的差異性,但每個(gè)組別中的樣本的群落分布具有相似性。物種相關(guān)性結(jié)果顯示:在屬水平總豐度前50物種中,厚壁菌和變形菌與其他的物種相關(guān)性較密切,而擬桿菌和放線(xiàn)菌與其他的物種相關(guān)性較低。5.腸道載菌量結(jié)果顯示機(jī)械性創(chuàng)傷后在CR、OAC和E.coli果蠅中,腸道載菌量均增加。CR果蠅實(shí)驗(yàn)組每只果蠅的腸道載菌量為(20.73±2.41)×10~6 CFU(P0.001);OAC果蠅實(shí)驗(yàn)組每只果蠅的腸道載菌量為(2.46±0.36)×10~6 CFU(P0.01);E.coli果蠅實(shí)驗(yàn)組每只果蠅的腸道載菌量為(24.67±0.94)×10~6 CFU(P0.01)。6.機(jī)械性創(chuàng)傷后果蠅模型中顯示:GF果蠅死亡指數(shù)低于CR果蠅,而補(bǔ)加OAC或E.coli又增加了GF果蠅的死亡指數(shù)(P0.001,P0.001),說(shuō)明腸道微生物加重了機(jī)械性創(chuàng)傷的嚴(yán)重程度。7.染料滲透性試驗(yàn)結(jié)果顯示:機(jī)械性創(chuàng)傷后24 h,CR果蠅出現(xiàn)Smurf現(xiàn)象百分率為(38.00±2.86)%(P0.001);GF、OAC和E.coli果蠅出現(xiàn)Smurf現(xiàn)象的百分率與其對(duì)照組相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01,P0.01,P0.001),說(shuō)明機(jī)械性創(chuàng)傷導(dǎo)致了腸道屏障功能紊亂,引起腸道屏障通透性增加。而CR、OAC和E.coli果蠅SI_(24)百分率與GF果蠅相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001,P0.01,P0.01),說(shuō)明腸道微生物的參與加重了機(jī)械創(chuàng)傷誘導(dǎo)的腸道屏障功能紊亂,導(dǎo)致腸道屏障通透性進(jìn)一步增加。8.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:機(jī)械性創(chuàng)傷后,GF果蠅體內(nèi)Attacin-C、Diptericin B基因的表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯升高(P0.05,P0.01);CR、OAC和E.coli果蠅中兩種基因的表達(dá)量均有升高。小鼠結(jié)腸組織中炎性細(xì)胞因子TNF-α、lL-6、lL-10的表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯升高(P0.01,P0.05,P0.05),說(shuō)明機(jī)械性創(chuàng)傷引起小鼠腸道組織炎性反應(yīng);緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯升高(P0.001,P0.01),說(shuō)明創(chuàng)傷引起小鼠腸道屏障通透性增加。9.抗生素處理結(jié)果顯示CR果蠅的死亡指數(shù)降低(P0.001);果蠅奔跑速度和攀爬速度與對(duì)照組相比提高(P0.001,P0.05);果蠅腸道載菌量降低(P0.01);SI_(24)百分率下降(P0.001),說(shuō)明抗生素的處理減輕了機(jī)械性創(chuàng)傷對(duì)果蠅腸道屏障的損害;Attacin-C、Diptericin B基因的表達(dá)水平下降(P0.05,P0.01)。說(shuō)明抗生素的干預(yù)降低了機(jī)械性創(chuàng)傷的嚴(yán)重程度。結(jié)論:本研究通過(guò)自由落體方法建立果蠅和小鼠創(chuàng)傷模型,進(jìn)一步探討腸道微生物群加重機(jī)械性創(chuàng)傷病理及其潛在機(jī)制。研究結(jié)果顯示機(jī)械性創(chuàng)傷引起機(jī)體病理性質(zhì)的改變并進(jìn)一步引起腸道微生物的組成與功能改變;腸道微生物加重機(jī)械性損傷誘導(dǎo)的腸屏障功能紊亂并刺激了機(jī)械性創(chuàng)傷誘導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)和腸道炎癥�？股馗深A(yù)可以減輕機(jī)械性創(chuàng)傷病理。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R-332;R641
【圖文】：

彈簧的一端固定在小板的一側(cè)，另外一端連墊；當(dāng)彈簧偏轉(zhuǎn)并釋放時(shí)（圖 A）小管迅速接觸聚小管壁后反彈（圖 B）。圖 C 為機(jī)械性創(chuàng)傷之前果蠅受機(jī)械性創(chuàng)傷后出現(xiàn)暫時(shí)性的暈厥，果蠅大部分易操作，并且可以在任意時(shí)刻觀察果蠅的狀態(tài)，但也作用時(shí)，沖擊面有弧度，導(dǎo)致果蠅受力不均勻；2）集成堆，下層的果蠅對(duì)上層的果蠅具有緩沖作用。3型的不足，我們做了進(jìn)一步的改進(jìn)：裝置如圖（附理為自由落體運(yùn)動(dòng)，將帶有果蠅的小管從不同高度自果蠅在機(jī)械性撞擊瞬間受到的機(jī)械性損傷隨自由落底端先觸底，特意用切片石蠟將醫(yī)用砂輪固定在小落體速度與位移公式：Vt= 2 gh。

械性創(chuàng)傷引起病理性結(jié)果械性創(chuàng)傷降低果蠅和小鼠存活率果蠅自 3 m、9 m、15 m 和 18 m 等不同的高度自由落體，測(cè)定機(jī)數(shù)。結(jié)果顯示，隨著自由落體高度的增加，果蠅死亡指數(shù)呈現(xiàn)增體的高度為 15 m 時(shí)，死亡指數(shù)為（55.33 ± 1.15）%，而對(duì)照組 ± 0.99）%，不同高度實(shí)驗(yàn)組死亡指數(shù)與對(duì)照組相比較均有顯著0.001）。由于 15 m 高度死亡指數(shù)超過(guò) 50 %，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選到不同次數(shù)的機(jī)械創(chuàng)傷，其 24 h 死亡指數(shù)呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，機(jī)為 1 h。當(dāng)機(jī)械創(chuàng)傷次數(shù)為 4 次時(shí)，果蠅的死亡指數(shù)為（85.83 ±。以 15 m 為機(jī)械性創(chuàng)傷高度的基點(diǎn)，小鼠在相同高度機(jī)械性創(chuàng)5%，機(jī)械性創(chuàng)傷后 48 h 存活率為 75%。以上結(jié)果說(shuō)明，機(jī)械性高度增加而增加，與我們的預(yù)期和實(shí)際相符合，說(shuō)明這個(gè)模型具。

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文性創(chuàng)傷模型中結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠的運(yùn)動(dòng)速度為（2.85 ± 0.61），其速度為（0.13 ± 0.06）cm/s（P < 0.01）；機(jī)械創(chuàng)傷后 20 分鐘為（0.19 ± 0.06）cm/s（P < 0.01）；機(jī)械創(chuàng)傷后 40 分鐘，小鼠的± 0.05）cm/s（P < 0.01）。對(duì)照組小鼠的攀爬頻率為（13.50 ± 0瞬間，小鼠的攀爬頻率為 0；機(jī)械創(chuàng)傷后 20 分鐘，小鼠的攀爬頻t/m，與對(duì)照組相比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.001）；機(jī)械創(chuàng)攀爬頻率為（0.75 ± 0.75）t/m（P < 0.001）。以上結(jié)果說(shuō)明，機(jī)小鼠運(yùn)動(dòng)能力下降。

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本文編號(hào)：2806829