【摘要】：【背景】沙眼衣原體泌尿生殖道感染是國內外常見的性傳播疾病,且發(fā)病率逐年上升,近年來已居于性傳播疾病的首位。據(jù)WHO統(tǒng)計,全世界每年大約新發(fā)沙眼衣原體感染約9200萬。大約2/3的沙眼衣原體感染者沒有臨床癥狀,易被忽視,無法得到及時的診治,引起一系列嚴重的并發(fā)癥和后遺癥。衣原體是一種區(qū)別于普通細菌的,具有特殊生物學特性的病原體,而臨床上將其作為普通細菌,給予抗生素治療,效果欠佳。衣原體噬菌體是一種以衣原體為宿主的噬菌體,部分衣原體噬菌體能引起宿主衣原體始體裂解性感染,并依靠簡單的粘附作用傳給下一代原體。利用衣原體噬菌體引起衣原體病變并使之裂解的特點,可將其作為生物制劑用于衣原體感染的治療,但目前尚未發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體的噬菌體。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)將純化的豚鼠嗜衣原體噬菌體phiCPG1衣殼蛋白Vp1作用于沙眼衣原體,能明顯抑制體外沙眼衣原體感染,對Vp1蛋白結構進行分析發(fā)現(xiàn),其含有七個插入環(huán),其中一個較大的插入環(huán)-IN5環(huán)暴露在噬菌體衣殼蛋白表面形成蘑菇樣的突起,推測Vp1蛋白的IN5環(huán)結構可能為最重要的功能區(qū)�！灸康摹刻剿鱉13-IN5重組噬菌體對E型沙眼衣原體和豚鼠嗜衣原體的作用�！緝热荨胯b定M13-IN5重組噬菌體IN5環(huán)目的片段;檢測M13-IN5重組噬菌體的效價;研究M13-IN5重組噬菌體IN5環(huán)蛋白的表達;將構建成功的M13-IN5重組噬菌體對沙眼衣原體E型標準株(CtE)和豚鼠嗜衣原體(Chlamydiadophila caviae)進行干預,利用光鏡觀察CtE在感染36h、48h、60h、72h的變化并檢測各干預時間點噬菌體活性,利用免疫熒光顯微鏡觀察豚鼠嗜衣原體在感染20h、24h、28h、32h的變化;利用激光掃描共聚焦顯微鏡精確定位M13-IN5重組噬菌體在Hela細胞內的位置�！痉椒ā坷秒p層平板法檢測重組噬菌體的效價。DNA提取試劑盒提取噬菌體DNA,進行PCR、酶切、測序,驗證重組噬菌體。提取噬菌體蛋白,Western Blot檢測重組噬菌體IN5環(huán)蛋白的表達。利用成功重組的噬菌體干預CtE,在CtE的培養(yǎng)過程中,加入效價均為10~(11)PFU/ml的M13噬菌體、M13-IN5重組噬菌體進行干預,并設置CtE對照組和空白對照組,在干預36h、48h、60h、72h,普通光學顯微鏡下觀察M13-IN5重組噬菌體對CtE作用;在干預36h,利用激光掃描共聚焦顯微鏡,觀察M13-IN5重組噬菌體在Hela細胞內的位置;收集噬菌體干預實驗各時段的培養(yǎng)基,用雙層平板法檢測噬菌體的效價,判斷重組噬菌體的活力和重組噬菌體在干預各時段的存活情況。在豚鼠嗜衣原體的培養(yǎng)過程中,加入效價均為10~(11)PFU/ml的M13噬菌體、M13-IN5重組噬菌體進行干預,并設置豚鼠嗜衣原體對照組和空白對照組,在干預20h、24h、28h、32h,通過免疫熒光顯微鏡觀察M13-IN5重組噬菌體對豚鼠嗜衣原體的作用。【結果】利用DNA重組技術獲得M13-IN5重組噬菌體,挑取單克隆擴增M13-IN5重組噬菌體,通過噬菌斑計數(shù)得到M13-IN5重組噬菌體滴度,LB平板培養(yǎng)顯示,M13-IN5重組噬菌體噬斑形成單位PFU=3.05×10~(11)/ml,提示M13-IN5重組噬菌體具有生物活力。M13-IN5重組噬菌體在大小約55kDa處有一較濃的蛋白帶,其大小正好與IN5環(huán)和M13噬菌體pIII外殼蛋白的融合蛋白(58.2kDa)大小相當,M13噬菌體組和大腸桿菌ER2738組在相應位置無條帶,這說明重組噬菌體IN5基因能夠正常表達。激光掃描共聚焦定位顯示,M13-IN5重組噬菌體熒光與CtE包涵體熒光存在重疊。M13-IN5重組噬菌體對CtE及豚鼠嗜衣原體均有抑制作用;CtE感染36、72 h時,M13-IN5重組噬菌體組和M13噬菌體組的包涵體數(shù)目較CtE對照組降低(P0.05),而且M13-IN5重組噬菌體組包涵體數(shù)目較M13噬菌體組有明顯降低(P0.05),而感染48 h、60h時,M13-IN5重組噬菌體組、M13噬菌體組、CtE對照組包涵體數(shù)目無明顯區(qū)別(P0.05);在豚鼠嗜衣原體感染中也出現(xiàn)沙眼衣原體干預實驗類似的結果,豚鼠嗜衣原體感染28h、32h,M13-IN5重組噬菌體組和M13噬菌體組的包涵體數(shù)目較豚鼠嗜衣原體對照組降低(P0.05),而且M13-IN5重組噬菌體組包涵體數(shù)目較M13噬菌體組明顯降低(P0.05),豚鼠嗜衣原體感染20h、24h,M13-IN5重組噬菌體組、M13噬菌體組、豚鼠嗜衣原體對照組包涵體數(shù)目無明顯區(qū)別(P0.05)�！窘Y論】M13-IN5重組噬菌體具有生物活性,且能夠成功表達IN5環(huán)蛋白;在體外實驗中,M13-IN5重組噬菌體能進入衣原體包涵體內,且能明顯抑制增殖期的沙眼衣原體E型標準株和生長周期晚期的豚鼠嗜衣原體感染。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R374
【圖文】：

酶切鑒定 1.DNA 標準帶；2.M13 噬菌體（體（分子量 7462bp）；4.M13-IN5 重組噬菌量分別在 4827bp 、 2622bp 處）測序由蘇州金唯智力生物科技有限公司完成，的 IN5 環(huán)基因序列。目的蛋白表達的鑒定菌體組在 55kDa 處有一較濃的蛋白帶（圖II 外殼蛋白的融合蛋白（58.2kDa）大小相當 組在相應位置無條帶。這說明重組噬菌體 I印跡鑒定 M.蛋白分子量標記物； 1.IN5 環(huán)腸桿菌 ER2738

圖 1.2 重組噬菌體酶切鑒定 1.DNA 標3.M13-IN5 重組噬菌體（分子量 7462bp成的 DNA 片段分子量分別在 4827bp 、1.2.2.3 重組噬菌體測序重組噬菌體測序由蘇州金唯智力生示重組噬菌體含有目的 IN5 環(huán)基因序列1.2.2.4 重組噬菌體目的蛋白表達的鑒M13-IN5 重組噬菌體組在 55kDa 處環(huán)和 M13 噬菌體 pIII 外殼蛋白的融合蛋和大腸桿菌 ER2738 組在相應位置無條表達。

純化的E型沙眼衣原體各稀釋倍數(shù)碘染觀察圖（400×）

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本文編號：2806359