【摘要】：第一部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及其外泌體的分離和鑒定[目的]從新生兒分娩后廢棄臍帶中分離出臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,通過(guò)成骨成脂定向誘導(dǎo)及表面標(biāo)記檢測(cè)等方法鑒定所獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞;無(wú)血清培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,收集無(wú)血清培養(yǎng)上清,超速離心法獲得外泌體,通過(guò)電鏡、表面標(biāo)記鑒定和粒徑分析檢測(cè)等方法鑒定所獲得的外泌體。[方法]1.無(wú)菌條件下取足月健康新生兒臍帶15cm左右,采用組織貼壁法分離出臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞;2.對(duì)所獲得的細(xì)胞進(jìn)行傳代純化,通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面標(biāo)記和成骨成脂定向誘導(dǎo)等方法進(jìn)行鑒定;3.利用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)所獲得的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,收集培養(yǎng)上清,超速離心法獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體;4.通過(guò)電鏡、表面標(biāo)記檢測(cè)和粒徑分析等方法對(duì)所獲得的外泌體進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]1.顯微鏡下觀察到,所獲得的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為大小均一、形態(tài)相似的長(zhǎng)梭形,呈旋渦狀生長(zhǎng);利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)到HUMSCs陽(yáng)性標(biāo)志物CD44、CD73、CD90、CD105表達(dá)率90%,陰性標(biāo)志物CD34、CD45、HLA-DR4表達(dá)率為0;成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色呈陽(yáng)性,成脂誘導(dǎo)后油紅O染色呈陽(yáng)性;免疫熒光結(jié)果顯示CD45、CD90、CD105、CD29均在細(xì)胞內(nèi)表達(dá);2.所獲得的HUMSCs來(lái)源的外泌體在電鏡下呈脂質(zhì)雙層膜圓球狀,大小均一、形狀規(guī)則、均勻分布;流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽(yáng)性表面標(biāo)記CD9、CD63、CD81表達(dá)率分別在70%、50%、90%左右;粒徑分析顆粒數(shù)與顆粒直徑比呈正態(tài)分布,平均粒徑135.5nm。[結(jié)論]1.組織貼壁法是獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的一種簡(jiǎn)便而穩(wěn)定的方法,利用組織貼壁法可以獲得純度較高的HUMSCs;2.可通過(guò)超速離心無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)上清的方法獲得純度較高、質(zhì)量穩(wěn)定的外泌體。第二部分 白消安致非人靈長(zhǎng)類無(wú)精子癥動(dòng)物模型的建立[目的]通過(guò)靜脈注射白消安,建立穩(wěn)定的非人靈長(zhǎng)類非梗阻性無(wú)精子癥動(dòng)物模型,為進(jìn)一步研究人類男性非梗阻性無(wú)精子癥提供理想的模型動(dòng)物。[方法]1.隨機(jī)選取青壯年雄性獼猴12只分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組;2.實(shí)驗(yàn)組收集儲(chǔ)存靜脈血,皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)后靜脈注射白消安6mg/kg;3.白消安注射后,回輸儲(chǔ)血,再次皮下注射G-CSF;4.每隔兩周檢測(cè)獼猴精子數(shù)量和活力以及曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)等各項(xiàng)指標(biāo),并與對(duì)照組對(duì)比分析,觀察白消安對(duì)獼猴生精功能的影響。[結(jié)果]1.白消安注射4周后,實(shí)驗(yàn)組獼猴死亡率為0;2.實(shí)驗(yàn)組獼猴體重?zé)o明顯變化,與對(duì)照組相比血常規(guī)和生化結(jié)果無(wú)異常;3.實(shí)驗(yàn)組獼猴精液常規(guī)檢測(cè)成熟活動(dòng)精子計(jì)數(shù)為0;睪丸組織切片觀察到曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)明顯破壞,出現(xiàn)明顯的“空泡樣”改變,生精上皮細(xì)胞層數(shù)和細(xì)胞數(shù)量明顯減少。[結(jié)論]1.白消安6mg/kg靜脈注射可以成功建立獼猴非梗阻性無(wú)精子癥模型;2.回輸儲(chǔ)血和皮下注射G-CSF可明顯減輕白消安對(duì)獼猴造血系統(tǒng)功能的影響,降低死亡率。第三部分HUMSCs及其外泌體復(fù)案人靈長(zhǎng)NOA動(dòng)物的生精功能[目的]探討臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞( HUMSCS)及其外泌體對(duì)非人靈長(zhǎng)類非梗阻性無(wú)精子癥模型動(dòng)物生精功能的恢復(fù)作用。[方法]1.隨機(jī)選擇12只青壯年獼猴,將其分為4組:干細(xì)胞 HUMSCS組、外泌體exosomes組、生理鹽水sPss組和空白對(duì)照 control組2.其中干細(xì)胞組、外泌體組、生理鹽水組孫猴單次靜脈注射白消安6mgkg建立非梗阻性無(wú)精子癥模型,并確定造模成功3.干細(xì)胞組睪丸曲細(xì)精管內(nèi)移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液;外泌體組睪丸曲細(xì)精管內(nèi)注射外泌體懸液:生理鹽水組睪丸曲細(xì)精管內(nèi)注射生理鹽水。4.第11周,分析對(duì)比各組獼猴間精子計(jì)數(shù)和活力、曲細(xì)精管組織結(jié)構(gòu)變化,評(píng)估 HUMSCS及其外泌體對(duì)非梗阻性無(wú)精子癥獼猴模型生精功能恢復(fù)作用。[結(jié)果]1.干細(xì)胞組和外泌體組獼猴精液中精子針相對(duì)于生理鹽水組明顯X椂�、活力灭嬙澡�

本文編號(hào)：2806171