【摘要】：目的:課題組前期通過高通量測序發(fā)現(xiàn)人脂肪干細胞(human adipose stem cells,hASCs)來源外泌體對急性肝衰竭(Acute liver failure,ALF)大鼠肝組織內(nèi)炎癥及趨化相關(guān)信號通路具有一定的抑制作用,本研究擬探索外泌體內(nèi)高表達的具有抑炎作用的miRNA治療ALF大鼠的可能機制。方法:1、通過共聚焦顯微鏡、ELISA及流式細胞術(shù)等檢測外泌體內(nèi)高表達的具有抑炎作用的miRNA對D-氨基半乳糖鹽酸鹽(D-gal)聯(lián)合脂多糖(LPS)活化的巨噬細胞釋放活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、炎癥因子(IL-1α、IL-6及TNF-α)及細胞凋亡率的影響,篩選出抑炎作用最強的miRNA。2、分別使用外泌體或過表達抑炎作用最強的miRNA外泌體治療D-gal/LPS誘導(dǎo)的ALF大鼠,或過表達抑炎作用最強的miRNA的慢病毒預(yù)處理大鼠并使用D-gal/LPS誘導(dǎo)其發(fā)生ALF,觀察大鼠生存率、肝功能及肝組織內(nèi)“P47phox-ROS-炎癥因子(IL-10、IL-1α、IL-6、TNF-α)”通路的變化。結(jié)果:外泌體內(nèi)高表達的六種具有抑炎作用的miRNA中,miR-19b-3p對活化巨噬細胞的抑炎作用最強,游離形式或外泌體形式miR-19b-3p可顯著抑制活化巨噬細胞內(nèi)P47phox、ROS及炎癥促進性細胞因子IL-1α、IL-6、TNF-α的表達,同時促進炎癥抑制性細胞因子IL-10的表達。過表達miR-19b-3p外泌體治療或過表達miR-19b-3p慢病毒預(yù)處理顯著改善急性肝衰竭大鼠一般情況,24h生存率及肝組織組織病理變化,限制抑制肝組織內(nèi)P47phox、ROS及多種炎癥因子及趨化因子表達。結(jié)論:過表達miR-19b-3p的外泌體可通過抑制活化巨噬細胞或ALF大鼠肝組織內(nèi)“P47phox-ROS”通路抑制炎癥因子及趨化因子表達減輕肝組織炎癥性損傷,從而提高ALF大鼠的生存率。
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575.3;R-332
【圖文】：

5ul FITC Annexin V 及 5ul PI。輕輕旋渦混勻，室溫避光孵育 15 分鐘。每管中加入 400ul 1X Binding Buffer，流式細胞儀上機檢測。1.3 統(tǒng)計學(xué)分析本課題的實驗數(shù)據(jù)均應(yīng)用 SPSS 21.0 軟件進行分析并以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，用 ANOVA 統(tǒng)計多組間差別，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2. 結(jié)果2.1 六種 miRNA 在活化巨噬細胞內(nèi)可檢測性如圖 1-1 所示，外泌體內(nèi)高表達的抑炎相關(guān)六種 miRNA 中，miR-221-3p、miR-19b-3p 及 miR-24-3p 在活化巨噬細胞內(nèi)可被檢測出，而 miR-214-3p、miR-193b-3p 及 miR-29a-3p 均未檢出，推測活化巨噬細胞內(nèi) miR-214-3p、miR193b-3p 及 miR-29a-3p 表達量極低，在后續(xù)的檢測中將僅針對 miR-221-3p、miR-19b-3p 及 miR-24-3p。

圖 2-3 共聚焦顯微鏡檢測各組巨噬細胞內(nèi) ROS 表達Fig. 2-3 ROS expression in macrophages in each group detected by confocal microscopy.4 ELISA 檢測細胞培養(yǎng)上清炎癥細胞因子的表達如圖所示，D-gal/LPS 活化巨噬細胞后，細胞內(nèi)炎癥性細胞因子 IL-1α、IL TNF-α表達量增加，細胞發(fā)生炎癥性損傷。miR-19b-3p mimic 轉(zhuǎn)染顯著減低化巨噬細胞內(nèi) IL-1α的表達（P＜0.05），TNF-α有所下降，但與陽性對照組比無明顯差異性，與 miR-19b-3p mimic 組相比，inhibitor 轉(zhuǎn)染組活化巨噬細胞-1α、TNF-α及 IL-6 的表達均增加，其中 IL-6 具有顯著差異性（P＜0.01）明 miR-19b-3p 可抑制活化巨噬細胞內(nèi)炎癥促進性細胞因子的表達，減少炎癥損傷。與 miR-24-3p inhibitor 組相比，活化巨噬細胞 miR-24-3p mimic 轉(zhuǎn)染組-1α及 TNF-α的表達均增加，IL-6 的表達雖較 inhibitor 轉(zhuǎn)染組低，但兩者的達均較陽性對照組高，說明 miR-24-3p 可促進活化巨噬細胞釋放炎癥細胞因，加重炎癥性損傷。活化巨噬細胞轉(zhuǎn)染 miR-221-3p mimic 后 TNF-α的表達受

圖 2-5 流式細胞術(shù)檢測三種 miRNAs 對活化巨噬細胞凋亡的影響Fig.2-5 The influence of three miRNAs on the apoptosis of activated macrophages wasdetected by flow表 2-1 各組 miRNA 對活化巨噬凋亡率數(shù)據(jù)統(tǒng)計表Tab. 2-1 The statistical data of activated macrophages apoptosis rate treated with differenmiRNA實驗分組 細胞存活率 早期凋亡 晚期凋亡 死亡率NC 85.8% 8.46% 2.41% 2.31%PC 73.7% 20.8% 3.58% 1.93%MiR-19b-3p mimic 77% 15% 4.84% 3.17%MiR-19b-3p inhibitor 9.31% 62.1% 25.6% 2.9%MiR-24-3p mimic 8.04% 64.2% 26.3% 1.52%MiR-24-3p inhibitor 29.8% 62.7% 5.41% 2.17%MiR-221-3p mimic 23.2% 71.2% 5.16% 0.426%MiR-221-3p inhibitor 5.16% 72.6% 20.5% 1.52%

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本文編號：2802665