【摘要】：研究背景:骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是關節(jié)骨科常見的一種疾病,近年來隨著交通事故和運動創(chuàng)傷發(fā)生率的不斷增高,前交叉韌帶(anterior cruciate ligaments,ACL)損傷繼而引發(fā)創(chuàng)傷性骨關節(jié)炎(post-traumatic osteoarthritis,PTOA)的發(fā)病率也逐年增高,致使OA發(fā)病率居高不下的同時出現(xiàn)了發(fā)病年齡逐漸年輕化的趨勢。目前已知在未經(jīng)治療的ACL損傷的膝關節(jié)中,會繼發(fā)關節(jié)半月板和軟骨退變,并最終出現(xiàn)創(chuàng)傷性骨關節(jié)炎。而經(jīng)過ACL重建手術(作為ACL損傷患者最常用的治療方式之一)治療的患者,長期隨訪發(fā)現(xiàn)雖然手術恢復了膝關節(jié)的穩(wěn)定性,但是仍有相當一部分患者最終發(fā)展為創(chuàng)傷性骨關節(jié)炎。這種已恢復穩(wěn)定的膝關節(jié)發(fā)生OA的病理機制尚未明確。目的:本課題研究旨在通過建立ACL重建術后膝關節(jié)OA動物模型,觀察ACL重建術后繼發(fā)的半月板,軟骨及軟骨下骨等膝關節(jié)組織學退變,同時檢測動物模型膝關節(jié)滑液中炎癥因子及相關蛋白表達豐度,驗證關節(jié)內(nèi)炎癥可能參與早期OA發(fā)生這一假設。與此同時,為了深入挖掘ACL重建相關OA的發(fā)病機制,我們擬通過關節(jié)軟骨蛋白質(zhì)組學方法篩選炎癥相關的表達差異蛋白,并從中選一特定蛋白進行體外實驗,以期發(fā)現(xiàn)其對軟骨細胞凋亡的影響。方法:1.獲取小型豬、羊(兩種最常見臨床前動物模型物種)正常膝關節(jié)MicroCT掃描斷層圖像數(shù)據(jù),使用Mimics、Geomagic Studio 2014、Pro/Engineer、Nastran等軟件建立膝關節(jié)三維幾何模型,并在驗證模型有效性的同時,通過屈膝30°和屈膝60°兩種ACL最易損傷狀態(tài)下的三維有限元應力載荷分析,對比小型豬和羊膝關節(jié)間的生物力學差異。從力學角度嘗試尋找適宜模擬人體ACL重建手術的臨床前動物模型。2.使用ACL自體原位移植法建立OA小型豬模型,并驗證該模型的時效性和穩(wěn)定性。使用形態(tài)學評分法,從早期骨贅形成、關節(jié)軟骨和半月板損傷三方面行小型豬膝關節(jié)OA改變的定量評估。利用印度墨汁染色、番紅O固綠染色等技術定性觀察膝關節(jié)OA組織學改變程度及趨勢。選取ACL重建術后1月、術后2月、術后3月和術后4月4個時間點,獲取膝關節(jié)軟骨組織。用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)方法定量軟骨組織中信使RNA(messenger RNA,mRNA)的表達情況,并抽取小型豬膝關節(jié)滑液用Luminex懸液芯片技術定量炎癥因子表達豐度。最后利用多元線性回歸模型分析炎癥因子與ACL重建術后關節(jié)OA組織學變化的相關性。3.采用串聯(lián)質(zhì)譜標簽(tandem mass tag,TMT)標記定量蛋白質(zhì)組學方法,通過同位素標簽特異性地標記蛋白多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團,而后進行串聯(lián)質(zhì)譜分析,比較OA小型豬模型軟骨組織中差異蛋白的相對含量。篩選出表達差異蛋白質(zhì)后,利用蛋白質(zhì)序列聚類分析、基因功能(gene ontology,GO)富集分析、京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析以及蛋白互作網(wǎng)絡分析(protein-protein interaction network,PPI network)等生物信息學方法,對篩選出的差異表達蛋白質(zhì)進行功能注釋及代謝或信號通路預測。4.在表達差異蛋白質(zhì)中選定與炎癥反應密切相關的膜聯(lián)蛋白A1(annexin A1,ANXA1)作為靶標蛋白,通過免疫組化染色和酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)驗證ANXA1蛋白在不同階段人膝關節(jié)OA組織標本中的表達變化。同時體外培養(yǎng)白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)誘導出現(xiàn)炎癥損傷反應(類OA改變)的小鼠肋軟骨細胞,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染含有ANXA1短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)質(zhì)粒,從而人為敲減ANXA1基因的內(nèi)源性表達,觀察其對軟骨細胞凋亡的影響。結(jié)果1.經(jīng)過三維有限元生物力學分析,對比了小型豬、羊膝關節(jié)在屈膝30°和屈膝60°彎矩荷載作用下關節(jié)內(nèi)各組織結(jié)構(gòu)的應力差異�？傮w而言,無論是小型豬還是羊,其膝關節(jié)各結(jié)構(gòu)的組織應力,均隨著屈膝角度的增加而增大。但是,在相同屈膝角度下,羊膝關節(jié)各組織結(jié)構(gòu)的應力峰值(屈膝30°:12.5MPa-30.4MPa;屈膝60°:17.9MPa-43.5MPa)整體要大于小型豬(屈膝30°:11.1MPa-20.2MPa;屈膝60°:15.9MPa-28.9MPa),且周圍韌帶中應力載荷的分布不均勻。其中羊的前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶的應力要比后交叉韌帶及外側(cè)副韌帶大很多。相反地,小型豬膝關節(jié)對應的軟骨、半月板及各周圍韌帶的應力值和變化規(guī)律則更接近于人體。2.⑴成功建立了ACL重建術后OA小型豬模型,并且通過印度墨汁染色、番紅O固綠染色等技術觀察到膝關節(jié)OA組織學改變出現(xiàn)在ACL重建術后3月時,證明該模型具有良好的時效性和可靠性。⑵在ACL重建組(idealized ACL reconstruction,IACLR)中觀察到顯著的以骨贅形成為主的OA組織學改變,并且伴有基質(zhì)金屬蛋白酶-1,13(matrix metalloproteinase-1,13,MMP-1,13)mRNA表達水平的增高和聚集蛋白聚糖(aggrecan,ACAN)mRNA及蛋白質(zhì)表達水平的降低。從而導致了IACLR組大體形態(tài)學評分顯著高于空白對照組。此外,IACLR組動物膝關節(jié)滑液中炎癥因子(如:IL-1β,4,6和腫瘤壞死因子tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表達顯著增加。最重要的是,通過多元線性回歸模型分析發(fā)現(xiàn)IL-1β,6和TNF-α濃度與OA形態(tài)學評分之間存在顯著相關性(其中重建手術組統(tǒng)計結(jié)果顯示:IL-1β,6和TNF-α其P值分別為0.023,0.006和0.001。而空白對照組也得到了IL-1β,6和TNF-α具有預測意義的統(tǒng)計結(jié)果,其P值分別為0.001,0.017和0.001)。3.采用TMT定量蛋白質(zhì)組學技術,在OA小型豬(Sus Scrofa科)模型軟骨組織中共鑒定到蛋白質(zhì)2950個。按照表達倍數(shù)變化1.2倍以上(上調(diào)大于1.2倍或者下調(diào)小于0.83)且P0.05的標準篩選出差異表達蛋白質(zhì)491個。其中,OA軟骨組織較正常軟骨組織上調(diào)的差異表達蛋白質(zhì)有198個,下調(diào)的差異表達蛋白質(zhì)293個。經(jīng)過GO功能和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),這些差異表達蛋白質(zhì)的功能主要是結(jié)合(binding)、催化活性(catalytic activity),結(jié)構(gòu)分子活性(structural molecule activity)、轉(zhuǎn)運活性(transporter activity)和分子功能調(diào)控(molecular function regulator)等。這些差異表達蛋白質(zhì)主要參與了細胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic結(jié)果:process)、生物調(diào)控(biological regulation)、生物過程調(diào)控(regulation of biological process)和細胞組分組織或合成(cellular component organization or biogenesis)等重要生物學過程。4.⑴選擇差異表達蛋白質(zhì)ANXA1為靶標蛋白,并通過免疫組化染色和ELISA檢測法,發(fā)現(xiàn)其在人膝關節(jié)OA不同階段軟骨組織標本和關節(jié)滑液標本中均有一定程度的表達,且存在著早期及中期OA標本中表達降低,而晚期OA則表達增高的規(guī)律。⑵經(jīng)過IL-1β試劑干預后誘導的炎癥損傷,小鼠肋軟骨細胞出現(xiàn)了類似OA軟骨細胞損傷的狀態(tài)。我們通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術人為敲減ANXA1基因在軟骨細胞中的表達后,通過流式細胞術觀察到了軟骨細胞早期凋亡減少的現(xiàn)象。結(jié)論:通過三維有限元分析,我們發(fā)現(xiàn)小型豬在模擬人膝關節(jié)屈膝狀態(tài)下應力載荷分布等方面更具優(yōu)勢。利用小型豬建立的ACL重建術后OA模型具有良好的穩(wěn)定性和時效性,并且通過該動物模型研究表明炎癥參與了此類OA的發(fā)病過程。采用TMT標記的蛋白質(zhì)組學方法,在小型豬OA軟骨組織中篩選出491個表達差異蛋白質(zhì)。其中,選定與炎癥密切相關的ANXA1蛋白作為新靶標,在人體不同階段OA組織標本中得到了表達驗證。最后在體外實驗中,我們發(fā)現(xiàn)ANXA1蛋白具有促進軟骨細胞凋亡的作用。當然,其發(fā)揮調(diào)控作用的分子機制還需進一步研究來證實。本課題為國家國際科技合作專項“α2巨球蛋白診斷及治療骨關節(jié)炎的合作研究(編號:2015DFA33050)”。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R687.4;R-332
【圖文】：

山西醫(yī)科大學博士學位論文lding”命令，設置相應灰度閾值區(qū)間，提取小型豬、羊膝關節(jié)等用軟件的擦除充填和自提取功能，對模型中的破洞、偽影和噪音高組織結(jié)構(gòu)的影像質(zhì)量。最終得到小型豬、羊膝關節(jié)的粗糙幾何TL 格式文件。用 Geomagic Studio 2014 軟件對 STL 格式文件進行細分降噪和過精確曲面等過程對其進行曲面擬合，最終得到完整小型豬、羊的三維實體模型，并保存為.STP 格式文件。具體的三維重建幾何 1-2 所示。

圖 2-3 懸液芯片標準品稀釋示意圖.2 樣品準備：（冰上操作）小型豬膝關節(jié)滑液樣本：10000rpm 離心 10min，取上清。離心后樣本原液檢測。.3 樣品孵育：①按照說明書要求，用去離子水重懸標準品、質(zhì)控品。輕輕混勻，放置于min，以保證其充分溶解。②用緩沖液對標準品進行稀釋，實驗共計稀釋 7 個梯度，S1-S7。③用 LA-BD微珠稀釋液按照說明書要求稀釋微珠，1400rpm 振蕩 30s，每孔量加入 96 孔板中。④加入稀釋好的標準品、對照 1、對照 2、空白對照和樣品，每孔 25μl，品孔中每孔加 25μl 緩沖液，標準品、對照 1、對照 2、空白對照孔每孔加 25液，貼上封口膜，放置在平板搖床上 850rpm 振蕩避光 4℃過夜孵育。

圖 3-1 TMT 試劑結(jié)構(gòu)（6 標）和同位素位置（*）研究中，我們發(fā)現(xiàn)炎癥因子（IL-1β、IL-6 和 TNF后 OA 的發(fā)病過程，那么究竟這些炎癥因子如何參接受哪些代謝或信號通路的調(diào)節(jié)呢？為了深入挖掘下來的第三部分研究中，我們依據(jù)蛋白質(zhì)組學的理分析技術，在 OA 小型豬膝關節(jié)軟骨組織中篩查并尤其是可能與炎癥調(diào)控相關的差異蛋白。同時，利富集分析等生物信息學方法，研究這些差異蛋白質(zhì)在學功能及參與的通路途經(jīng)。

【參考文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 于川東;miR-126沉默能夠上調(diào)Bcl-2并且能通過抑制MAPK和JNK信號通路活性來減輕IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥損傷[D];山東大學;2018年

本文編號：2802765