【摘要】：研究背景:骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是關(guān)節(jié)骨科常見(jiàn)的一種疾病,近年來(lái)隨著交通事故和運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷發(fā)生率的不斷增高,前交叉韌帶(anterior cruciate ligaments,ACL)損傷繼而引發(fā)創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎(post-traumatic osteoarthritis,PTOA)的發(fā)病率也逐年增高,致使OA發(fā)病率居高不下的同時(shí)出現(xiàn)了發(fā)病年齡逐漸年輕化的趨勢(shì)。目前已知在未經(jīng)治療的ACL損傷的膝關(guān)節(jié)中,會(huì)繼發(fā)關(guān)節(jié)半月板和軟骨退變,并最終出現(xiàn)創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎。而經(jīng)過(guò)ACL重建手術(shù)(作為ACL損傷患者最常用的治療方式之一)治療的患者,長(zhǎng)期隨訪發(fā)現(xiàn)雖然手術(shù)恢復(fù)了膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性,但是仍有相當(dāng)一部分患者最終發(fā)展為創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎。這種已恢復(fù)穩(wěn)定的膝關(guān)節(jié)發(fā)生OA的病理機(jī)制尚未明確。目的:本課題研究旨在通過(guò)建立ACL重建術(shù)后膝關(guān)節(jié)OA動(dòng)物模型,觀察ACL重建術(shù)后繼發(fā)的半月板,軟骨及軟骨下骨等膝關(guān)節(jié)組織學(xué)退變,同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物模型膝關(guān)節(jié)滑液中炎癥因子及相關(guān)蛋白表達(dá)豐度,驗(yàn)證關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥可能參與早期OA發(fā)生這一假設(shè)。與此同時(shí),為了深入挖掘ACL重建相關(guān)OA的發(fā)病機(jī)制,我們擬通過(guò)關(guān)節(jié)軟骨蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選炎癥相關(guān)的表達(dá)差異蛋白,并從中選一特定蛋白進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),以期發(fā)現(xiàn)其對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響。方法:1.獲取小型豬、羊(兩種最常見(jiàn)臨床前動(dòng)物模型物種)正常膝關(guān)節(jié)MicroCT掃描斷層圖像數(shù)據(jù),使用Mimics、Geomagic Studio 2014、Pro/Engineer、Nastran等軟件建立膝關(guān)節(jié)三維幾何模型,并在驗(yàn)證模型有效性的同時(shí),通過(guò)屈膝30°和屈膝60°兩種ACL最易損傷狀態(tài)下的三維有限元應(yīng)力載荷分析,對(duì)比小型豬和羊膝關(guān)節(jié)間的生物力學(xué)差異。從力學(xué)角度嘗試尋找適宜模擬人體ACL重建手術(shù)的臨床前動(dòng)物模型。2.使用ACL自體原位移植法建立OA小型豬模型,并驗(yàn)證該模型的時(shí)效性和穩(wěn)定性。使用形態(tài)學(xué)評(píng)分法,從早期骨贅形成、關(guān)節(jié)軟骨和半月板損傷三方面行小型豬膝關(guān)節(jié)OA改變的定量評(píng)估。利用印度墨汁染色、番紅O固綠染色等技術(shù)定性觀察膝關(guān)節(jié)OA組織學(xué)改變程度及趨勢(shì)。選取ACL重建術(shù)后1月、術(shù)后2月、術(shù)后3月和術(shù)后4月4個(gè)時(shí)間點(diǎn),獲取膝關(guān)節(jié)軟骨組織。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)方法定量軟骨組織中信使RNA(messenger RNA,mRNA)的表達(dá)情況,并抽取小型豬膝關(guān)節(jié)滑液用Luminex懸液芯片技術(shù)定量炎癥因子表達(dá)豐度。最后利用多元線性回歸模型分析炎癥因子與ACL重建術(shù)后關(guān)節(jié)OA組織學(xué)變化的相關(guān)性。3.采用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tag,TMT)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法,通過(guò)同位素標(biāo)簽特異性地標(biāo)記蛋白多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán),而后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析,比較OA小型豬模型軟骨組織中差異蛋白的相對(duì)含量。篩選出表達(dá)差異蛋白質(zhì)后,利用蛋白質(zhì)序列聚類分析、基因功能(gene ontology,GO)富集分析、京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析以及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析(protein-protein interaction network,PPI network)等生物信息學(xué)方法,對(duì)篩選出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋及代謝或信號(hào)通路預(yù)測(cè)。4.在表達(dá)差異蛋白質(zhì)中選定與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的膜聯(lián)蛋白A1(annexin A1,ANXA1)作為靶標(biāo)蛋白,通過(guò)免疫組化染色和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)驗(yàn)證ANXA1蛋白在不同階段人膝關(guān)節(jié)OA組織標(biāo)本中的表達(dá)變化。同時(shí)體外培養(yǎng)白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)誘導(dǎo)出現(xiàn)炎癥損傷反應(yīng)(類OA改變)的小鼠肋軟骨細(xì)胞,通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染含有ANXA1短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)質(zhì)粒,從而人為敲減ANXA1基因的內(nèi)源性表達(dá),觀察其對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果1.經(jīng)過(guò)三維有限元生物力學(xué)分析,對(duì)比了小型豬、羊膝關(guān)節(jié)在屈膝30°和屈膝60°彎矩荷載作用下關(guān)節(jié)內(nèi)各組織結(jié)構(gòu)的應(yīng)力差異�？傮w而言,無(wú)論是小型豬還是羊,其膝關(guān)節(jié)各結(jié)構(gòu)的組織應(yīng)力,均隨著屈膝角度的增加而增大。但是,在相同屈膝角度下,羊膝關(guān)節(jié)各組織結(jié)構(gòu)的應(yīng)力峰值(屈膝30°:12.5MPa-30.4MPa;屈膝60°:17.9MPa-43.5MPa)整體要大于小型豬(屈膝30°:11.1MPa-20.2MPa;屈膝60°:15.9MPa-28.9MPa),且周圍韌帶中應(yīng)力載荷的分布不均勻。其中羊的前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶的應(yīng)力要比后交叉韌帶及外側(cè)副韌帶大很多。相反地,小型豬膝關(guān)節(jié)對(duì)應(yīng)的軟骨、半月板及各周圍韌帶的應(yīng)力值和變化規(guī)律則更接近于人體。2.⑴成功建立了ACL重建術(shù)后OA小型豬模型,并且通過(guò)印度墨汁染色、番紅O固綠染色等技術(shù)觀察到膝關(guān)節(jié)OA組織學(xué)改變出現(xiàn)在ACL重建術(shù)后3月時(shí),證明該模型具有良好的時(shí)效性和可靠性。⑵在ACL重建組(idealized ACL reconstruction,IACLR)中觀察到顯著的以骨贅形成為主的OA組織學(xué)改變,并且伴有基質(zhì)金屬蛋白酶-1,13(matrix metalloproteinase-1,13,MMP-1,13)mRNA表達(dá)水平的增高和聚集蛋白聚糖(aggrecan,ACAN)mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的降低。從而導(dǎo)致了IACLR組大體形態(tài)學(xué)評(píng)分顯著高于空白對(duì)照組。此外,IACLR組動(dòng)物膝關(guān)節(jié)滑液中炎癥因子(如:IL-1β,4,6和腫瘤壞死因子tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表達(dá)顯著增加。最重要的是,通過(guò)多元線性回歸模型分析發(fā)現(xiàn)IL-1β,6和TNF-α濃度與OA形態(tài)學(xué)評(píng)分之間存在顯著相關(guān)性(其中重建手術(shù)組統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:IL-1β,6和TNF-α其P值分別為0.023,0.006和0.001。而空白對(duì)照組也得到了IL-1β,6和TNF-α具有預(yù)測(cè)意義的統(tǒng)計(jì)結(jié)果,其P值分別為0.001,0.017和0.001)。3.采用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),在OA小型豬(Sus Scrofa科)模型軟骨組織中共鑒定到蛋白質(zhì)2950個(gè)。按照表達(dá)倍數(shù)變化1.2倍以上(上調(diào)大于1.2倍或者下調(diào)小于0.83)且P0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選出差異表達(dá)蛋白質(zhì)491個(gè)。其中,OA軟骨組織較正常軟骨組織上調(diào)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)有198個(gè),下調(diào)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)293個(gè)。經(jīng)過(guò)GO功能和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能主要是結(jié)合(binding)、催化活性(catalytic activity),結(jié)構(gòu)分子活性(structural molecule activity)、轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transporter activity)和分子功能調(diào)控(molecular function regulator)等。這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要參與了細(xì)胞過(guò)程(cellular process)、代謝過(guò)程(metabolic結(jié)果:process)、生物調(diào)控(biological regulation)、生物過(guò)程調(diào)控(regulation of biological process)和細(xì)胞組分組織或合成(cellular component organization or biogenesis)等重要生物學(xué)過(guò)程。4.⑴選擇差異表達(dá)蛋白質(zhì)ANXA1為靶標(biāo)蛋白,并通過(guò)免疫組化染色和ELISA檢測(cè)法,發(fā)現(xiàn)其在人膝關(guān)節(jié)OA不同階段軟骨組織標(biāo)本和關(guān)節(jié)滑液標(biāo)本中均有一定程度的表達(dá),且存在著早期及中期OA標(biāo)本中表達(dá)降低,而晚期OA則表達(dá)增高的規(guī)律。⑵經(jīng)過(guò)IL-1β試劑干預(yù)后誘導(dǎo)的炎癥損傷,小鼠肋軟骨細(xì)胞出現(xiàn)了類似OA軟骨細(xì)胞損傷的狀態(tài)。我們通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)人為敲減ANXA1基因在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)后,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)觀察到了軟骨細(xì)胞早期凋亡減少的現(xiàn)象。結(jié)論:通過(guò)三維有限元分析,我們發(fā)現(xiàn)小型豬在模擬人膝關(guān)節(jié)屈膝狀態(tài)下應(yīng)力載荷分布等方面更具優(yōu)勢(shì)。利用小型豬建立的ACL重建術(shù)后OA模型具有良好的穩(wěn)定性和時(shí)效性,并且通過(guò)該動(dòng)物模型研究表明炎癥參與了此類OA的發(fā)病過(guò)程。采用TMT標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)方法,在小型豬OA軟骨組織中篩選出491個(gè)表達(dá)差異蛋白質(zhì)。其中,選定與炎癥密切相關(guān)的ANXA1蛋白作為新靶標(biāo),在人體不同階段OA組織標(biāo)本中得到了表達(dá)驗(yàn)證。最后在體外實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)ANXA1蛋白具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡的作用。當(dāng)然,其發(fā)揮調(diào)控作用的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。本課題為國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)“α2巨球蛋白診斷及治療骨關(guān)節(jié)炎的合作研究(編號(hào):2015DFA33050)”。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R687.4;R-332
【圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文lding”命令，設(shè)置相應(yīng)灰度閾值區(qū)間，提取小型豬、羊膝關(guān)節(jié)等用軟件的擦除充填和自提取功能，對(duì)模型中的破洞、偽影和噪音高組織結(jié)構(gòu)的影像質(zhì)量。最終得到小型豬、羊膝關(guān)節(jié)的粗糙幾何TL 格式文件。用 Geomagic Studio 2014 軟件對(duì) STL 格式文件進(jìn)行細(xì)分降噪和過(guò)精確曲面等過(guò)程對(duì)其進(jìn)行曲面擬合，最終得到完整小型豬、羊的三維實(shí)體模型，并保存為.STP 格式文件。具體的三維重建幾何 1-2 所示。

圖 2-3 懸液芯片標(biāo)準(zhǔn)品稀釋示意圖.2 樣品準(zhǔn)備：（冰上操作）小型豬膝關(guān)節(jié)滑液樣本：10000rpm 離心 10min，取上清。離心后樣本原液檢測(cè)。.3 樣品孵育：①按照說(shuō)明書(shū)要求，用去離子水重懸標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品。輕輕混勻，放置于min，以保證其充分溶解。②用緩沖液對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，實(shí)驗(yàn)共計(jì)稀釋 7 個(gè)梯度，S1-S7。③用 LA-BD微珠稀釋液按照說(shuō)明書(shū)要求稀釋微珠，1400rpm 振蕩 30s，每孔量加入 96 孔板中。④加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照 1、對(duì)照 2、空白對(duì)照和樣品，每孔 25μl，品孔中每孔加 25μl 緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照 1、對(duì)照 2、空白對(duì)照孔每孔加 25液，貼上封口膜，放置在平板搖床上 850rpm 振蕩避光 4℃過(guò)夜孵育。

圖 3-1 TMT 試劑結(jié)構(gòu)（6 標(biāo)）和同位素位置（*）研究中，我們發(fā)現(xiàn)炎癥因子（IL-1β、IL-6 和 TNF后 OA 的發(fā)病過(guò)程，那么究竟這些炎癥因子如何參接受哪些代謝或信號(hào)通路的調(diào)節(jié)呢？為了深入挖掘下來(lái)的第三部分研究中，我們依據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)的理分析技術(shù)，在 OA 小型豬膝關(guān)節(jié)軟骨組織中篩查并尤其是可能與炎癥調(diào)控相關(guān)的差異蛋白。同時(shí)，利富集分析等生物信息學(xué)方法，研究這些差異蛋白質(zhì)在學(xué)功能及參與的通路途經(jīng)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 于川東;miR-126沉默能夠上調(diào)Bcl-2并且能通過(guò)抑制MAPK和JNK信號(hào)通路活性來(lái)減輕IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥損傷[D];山東大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2802765