發(fā)布時間：2020-08-22 13:00

【摘要】：研究背景:近些年來,泛耐藥菌和多重耐藥菌的檢出率不斷上升,針對一線抗生素的耐藥率逐漸升高。特別是隨著超級耐藥菌的出現(xiàn),抗感染治療面臨無藥可用的局面。細菌耐藥性的快速流行已成為一個亟待解決的全球性衛(wèi)生問題。耐藥基因往往定位于細菌質(zhì)粒,具備極強的跨菌種水平轉(zhuǎn)移能力。目前針對泛耐藥菌和超級耐藥菌的治療方式及其有限,尚無有效的技術(shù)手段阻斷耐藥性的擴散轉(zhuǎn)移。耐藥菌感染治療、防控等領(lǐng)域亟需新技術(shù)和新策略。CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)來源于細菌的特異性免疫機制CRISPR系統(tǒng),能夠?qū)δ康腄NA實現(xiàn)序列特異性的剪切。近年來已有研究報道將CRISPR系統(tǒng)包裝至溫和噬菌體中,通過噬菌體遞呈CRISPR系統(tǒng),致死性地剪切細菌靶基因。這些研究提供了利用CRISPR工具對抗耐藥菌的思路,但還遺留很多缺陷。首先,之前的研究主要通過溫和噬菌體遞呈CRISPR靶向細菌染色體的策略進行殺菌,缺少靶向質(zhì)粒策略抗耐藥菌效果的深入分析,尤其缺少體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)。其次,當前研究顯示的噬菌體遞呈CRISPR技術(shù)殺菌效力有限,遠遠低于傳統(tǒng)的烈性噬菌體殺菌技術(shù),達不到實用水平。另外,噬菌體包裝技術(shù)需要改進以避免抗性篩選標記被引入包裝后的噬菌體基因組,并提高包裝噬菌體的效率和對新噬菌體的適用性。最后,以往研究只評價了1~2天內(nèi)包裝CRISPR-Cas噬菌體的抗菌能力,還需要在更長的觀測時間里進行持續(xù)觀測和分析。研究目的:細菌耐藥性主要由耐藥質(zhì)粒進行介導(dǎo)和傳播。利用原核CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)清除細菌耐藥質(zhì)粒,能夠恢復(fù)抗生素的殺菌效力,并阻斷細菌耐藥性的傳播。利用更加高效的原核載體技術(shù),攜帶靶向細菌耐藥質(zhì)粒的CRISPR-Cas9系統(tǒng)更加高效的向耐藥菌遞呈,將大大增加該系統(tǒng)在抗耐藥菌領(lǐng)域的實際應(yīng)用潛力。本研究將建立CRISPR-Cas9高效清除細菌耐藥性技術(shù)。設(shè)計并構(gòu)建特異性CRISPR-Cas9系統(tǒng)來分析靶向清除NDM-1耐藥質(zhì)粒的效果。在此基礎(chǔ)上,我們利用溫和噬菌體作為CRISPR-Cas9系統(tǒng)的高效遞呈載體。通過研發(fā)新型溫和噬菌體包裝CRISPR-Cas9技術(shù),實現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)的“一步法”包裝,探索從溫和噬菌體分離到完成包裝的技術(shù)流程。利用噬菌體遞呈CRISPR-Cas9系統(tǒng),在一系列的體內(nèi)外實驗中檢驗細菌耐藥性的清除效率,并分析聯(lián)合抗生素抗耐藥菌策略。通過持續(xù)監(jiān)測對耐藥菌生長的抑制效果,分析噬菌體遞呈CRISPR-Cas9抗菌策略是否能避免新的細菌耐受突變的產(chǎn)生,是否具有比烈性噬菌體直接殺菌策略更加持久的抑菌效力。研究方法:建立針對超級耐藥基因bla_(NDM-1)的CRISPR-Cas9靶點spacer文庫,構(gòu)建靶向NDM-1質(zhì)粒的CRISPR-Cas9系統(tǒng)質(zhì)粒。構(gòu)建攜帶NDM-1質(zhì)粒的耐藥大腸桿菌模型,采用定量PCR及熒光信號檢測等方法分析CRISPR-Cas9系統(tǒng)清除NDM-1質(zhì)粒的效率,藥敏實驗檢驗?zāi)退庂|(zhì)粒清除后細菌耐藥表型的變化。通過上述實驗驗證CRISPR-Cas9系統(tǒng)高效清除細菌耐藥質(zhì)粒的能力。設(shè)計引入抗性篩選的新型重組噬菌體篩選系統(tǒng),建立“一步法”溫和噬菌體整合CRISPR-Cas9技術(shù)。采用該包裝技術(shù)改造一株新分離的大腸桿菌溫和噬菌體,使其遞呈CRISPR-Cas9系統(tǒng),并靶向剪切攜帶bla_(NDM-1)靶點的質(zhì)粒。利用包裝CRISPR-Cas9噬菌體侵染攜帶靶質(zhì)粒的大腸桿菌,分析噬菌體遞呈的CRISPR-Cas9系統(tǒng)清除細菌耐藥性的能力,包括PCR檢測靶質(zhì)粒的清除效果,定量PCR分析靶質(zhì)粒清除效率,菌落計數(shù)法統(tǒng)計耐藥細菌的敏感化率。利用包裝CRISPR-Cas9噬菌體介入細菌耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、接合等水平轉(zhuǎn)移途徑,評價噬菌體遞呈CRISPR-Cas9系統(tǒng)清除細菌耐藥質(zhì)粒在阻斷細菌耐藥性傳播擴散方面的效果。建立溫和噬菌體遞呈CRISPR-Cas9聯(lián)合抗生素的抗耐藥菌策略,在包括生物膜、小鼠皮膚感染模型、小鼠腸道感染模型等體內(nèi)外條件下檢驗該策略的耐藥性清除及耐藥菌殺滅效力。對聯(lián)合抗耐藥菌策略的殺菌效力進行至少1周時間內(nèi)的連續(xù)監(jiān)測,觀察是否會出現(xiàn)細菌對該策略的耐受突變,并和烈性噬菌體直接殺菌策略的耐受突變相比較。采用全基因組測序分析細菌產(chǎn)生噬菌體耐受突變的機制。研究結(jié)果:(1)建立了針對bla_(NDM-1)基因的CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶點文庫,包含20條特異性spacer序列。構(gòu)建了靶向剪切bla_(NDM-1)基因的特異性原核CRISPR-Cas9系統(tǒng)質(zhì)粒。(2)利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)清除大腸桿菌的NDM-1質(zhì)粒,使產(chǎn)NDM-1耐藥模式菌變?yōu)閎la_(NDM-1)陰性,恢復(fù)細菌對亞胺培南及其它β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性。(3)證明原核CRISPR-Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)化耐藥菌可以高效清除大腸桿菌中攜帶的NDM-1質(zhì)粒。證明無論是天然的NDM-1大質(zhì)粒還是重組NDM-1高拷貝質(zhì)粒均可以在12 h內(nèi)實現(xiàn)大于99%的細胞內(nèi)清除率。(4)建立了新的噬菌體包裝CRISPR-Cas9技術(shù),首次探索完成了大腸桿菌溫和噬菌體從分離測序到“一步法”包裝CRISPR-Cas9系統(tǒng)的整套技術(shù)流程。(5)檢驗了噬菌體遞呈CRISPR-Cas9系統(tǒng)在體外條件下清除靶質(zhì)粒的效率,發(fā)現(xiàn)在8小時內(nèi)能實現(xiàn)大于99%的耐藥質(zhì)粒清除率。提出利用噬菌體遞呈CRISPR-Cas9清除細菌耐藥性聯(lián)合抗生素殺死耐藥菌的策略,在體外實驗中降低了約10~6倍的耐藥大腸桿菌數(shù)量,優(yōu)于已報道研究中所采用的細菌染色體靶向策略。(6)噬菌體遞呈CRISPR-Cas9抗菌技術(shù)能夠減少細菌耐藥質(zhì)粒在環(huán)境中的釋放和積累,相比烈性噬菌體在8小時內(nèi)減少了約98.7%的耐藥質(zhì)粒釋放。噬菌體遞呈CRISPR-Cas9抗菌技術(shù)可阻斷耐藥質(zhì)粒在細菌間的接合轉(zhuǎn)移,減少了98%的pNDM-1接合子菌落數(shù)量,抑制細菌耐藥性的傳播擴散。(7)首次在形成生物膜的耐藥菌中評價噬菌體遞呈CRISPR系統(tǒng)技術(shù),并證明該技術(shù)能夠在成熟生物膜中清除約50%的耐藥質(zhì)粒,將抗生素的最低生物膜清除濃度降低50%。(8)首次在體內(nèi)實驗中評價CRISPR靶向細菌耐藥質(zhì)粒的策略,噬菌體遞呈CRISPR系統(tǒng)能夠在小鼠皮膚感染模型和小鼠腸道感染模型中發(fā)揮清除細菌耐藥質(zhì)粒的作用并聯(lián)合抗生素實現(xiàn)10~5~10~6倍的耐藥大腸桿菌數(shù)的降低,效果優(yōu)于已報道的CRISPR靶向細菌染色體策略。(9)在體外條件下進行長時間殺菌效果監(jiān)測,烈性噬菌體殺菌策略在24小時內(nèi)快速引發(fā)細菌的噬菌體耐受現(xiàn)象。而192小時內(nèi)未觀察到細菌對包裝CRISPR-Cas9噬菌體聯(lián)合抗生素殺菌策略的新耐受現(xiàn)象。體內(nèi)條件下,在小鼠皮膚和腸道耐藥菌感染模型中持續(xù)監(jiān)測該策略,烈性噬菌體策略在2-3天內(nèi)出現(xiàn)細菌的耐受,而7天內(nèi)未觀察到細菌對包裝CRISPR-Cas9噬菌體聯(lián)合抗生素殺菌策略的耐受。(10)通過對耐受突變株的全基因組測序,揭示大腸桿菌MG1655形成烈性噬菌體vB_253耐受的機制是在fepA基因位點出現(xiàn)堿基突變;大腸桿菌MG1655形成卡那霉素耐受的機制是在fusA基因位點出現(xiàn)堿基突變。而噬菌體遞呈CRISPR-Cas9系統(tǒng)清除細菌耐藥質(zhì)粒聯(lián)合抗生素殺菌的策略不會導(dǎo)致細菌出現(xiàn)上述基因突變。研究結(jié)論:本研究提出了利用噬菌體遞呈CRISPR-Cas9系統(tǒng)清除細菌耐藥性的策略。在方法學(xué)上新建了溫和噬菌體“一步法”包裝CRISPR-Cas9系統(tǒng)技術(shù)。利用噬菌體遞呈CRISPR-Cas9系統(tǒng)高效靶向清除細菌耐藥質(zhì)粒的策略,破壞了介導(dǎo)細菌耐藥性的質(zhì)粒,阻斷細菌耐藥性的傳播,降低菌群環(huán)境中的耐藥基因水平,具備開發(fā)成為細菌耐藥性防控新技術(shù)的潛力。在耐藥菌治療方面,噬菌體遞呈CRISPR-Cas9清除細菌耐藥性并聯(lián)合應(yīng)用抗生素在體內(nèi)外一系列實驗中實現(xiàn)了強大的殺滅耐藥菌能力。該策略不僅解決了由耐藥基因介導(dǎo)的細菌耐藥性問題,使失效的抗生素療法重新煥發(fā)生機,還避免了殺菌過程中可能出現(xiàn)的耐受突變,有望成為一種有效殺滅耐藥菌的新方法,在抗耐藥菌領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R378
【圖文】：

在不同菌株和菌種間傳播。以介導(dǎo)耐受碳該基因在 2010 年被首次報道發(fā)現(xiàn)，同年的不動桿菌，并發(fā)現(xiàn)該基因定位于可移現(xiàn)，產(chǎn) NDM-1 菌在我國醫(yī)院臨床、環(huán)境位于可移動質(zhì)粒，并且涉及了多種質(zhì)粒類藥基因的跨菌種快速傳播。因此，清除細性，又可以破壞耐藥基因的傳播載體，進菌的治療和防控。術(shù)的發(fā)展為研究人員提供了高效便捷的基領(lǐng)域也得到了廣泛應(yīng)用[33]。利用 CRISP細菌基因位點，并使 DNA 發(fā)生雙鏈斷裂斷裂的 DNA 雙鏈在細菌細胞內(nèi)核酸酶的們的研究將 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)設(shè)定為靶向耐受碳青酶烯類抗生素的 NDM-1 質(zhì)粒[34藥菌的敏感化，見圖 1.1。

軍事科學(xué)院博士學(xué)位論文中 blaNDM-1和 cas9 基因。見圖 1.1 a，每個質(zhì)粒挑選 個轉(zhuǎn)化菌落作展示，粒的轉(zhuǎn)化子中均檢測不到 blaNDM-1基因。挑選pCas9-T1質(zhì)粒進 步分析清除pNDM-1的細菌占總細菌比例，并以pC粒載體轉(zhuǎn)化組對照。分別從轉(zhuǎn)化了 pCas9-T1 的實驗組平板和轉(zhuǎn)化 pCas9 空照組的平板上挑選 15 個單菌落，blaNDM-1基因的陽性情況如圖 1.1 所示：實15 個菌落全部呈 blaNDM-1陰性，表明經(jīng) Cas9 核酸酶的特異性剪切后，該基因 PCR 擴增。在挑選的 15 個轉(zhuǎn)化子中剪切成功率為 100%。而對照組 Cas9缺少 gRNA 的引導(dǎo)作用，未對 blaNDM-1 進行特異性切割。采用三對引NDM-F/NDM-R，NDM(Sal)-F/NDM(Xba)-R，NDM3-F/NDM3-R）再次驗as9-T1 實驗組中大腸桿菌單菌落攜帶 blaNDM-1 情況，PCR 結(jié)果均表明特異ISPR 系統(tǒng)能夠剪切破壞 blaNDM-1基因。

第 22 頁圖 1.3 J53 模式菌耐藥表型的轉(zhuǎn)變a：Etest 試紙條檢測金屬酶表達情況b：Etest 試紙條檢測亞胺培南 MIC 值c：亞胺培南 MIC 值統(tǒng)計分析1.3.4 CRISPR 系統(tǒng)剪切清除 pNDM-1 效率的分析對耐藥質(zhì)粒的清除效率關(guān)系到 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)清除耐藥質(zhì)粒技術(shù)的實性，也能給細菌敏感化后的抗生素聯(lián)用時機提供參考。本研究深入分析了 pCas9-T清除 J53 細胞內(nèi) pNDM-1 的效率。采用定量 PCR（quantitative PCR，qPCR）的法，以 16S 基因為內(nèi)參，計算轉(zhuǎn)化 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)后第 2、4、8、16 和 32 小等時間點上 pNDM-1 拷貝量的變化，見圖 1.3。定量分析發(fā)現(xiàn)，CRISPR 系統(tǒng)清pNDM-1 速度極快，在 2 小時即清除了約 50%的耐藥質(zhì)粒，在 8 小時即實現(xiàn)了于 99.9%的清除效率，并且耐藥質(zhì)粒的清除作用 直持續(xù)到第 32 小時。雖pNDM-1 質(zhì)粒有潛在的恢復(fù)自身拷貝的可能，但經(jīng)本實驗證實 CRISPR 清

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 賈盤興;徐星;余茂R

本文編號：2800717