【摘要】：研究背景:近些年來,泛耐藥菌和多重耐藥菌的檢出率不斷上升,針對(duì)一線抗生素的耐藥率逐漸升高。特別是隨著超級(jí)耐藥菌的出現(xiàn),抗感染治療面臨無藥可用的局面。細(xì)菌耐藥性的快速流行已成為一個(gè)亟待解決的全球性衛(wèi)生問題。耐藥基因往往定位于細(xì)菌質(zhì)粒,具備極強(qiáng)的跨菌種水平轉(zhuǎn)移能力。目前針對(duì)泛耐藥菌和超級(jí)耐藥菌的治療方式及其有限,尚無有效的技術(shù)手段阻斷耐藥性的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。耐藥菌感染治療、防控等領(lǐng)域亟需新技術(shù)和新策略。CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)來源于細(xì)菌的特異性免疫機(jī)制CRISPR系統(tǒng),能夠?qū)δ康腄NA實(shí)現(xiàn)序列特異性的剪切。近年來已有研究報(bào)道將CRISPR系統(tǒng)包裝至溫和噬菌體中,通過噬菌體遞呈CRISPR系統(tǒng),致死性地剪切細(xì)菌靶基因。這些研究提供了利用CRISPR工具對(duì)抗耐藥菌的思路,但還遺留很多缺陷。首先,之前的研究主要通過溫和噬菌體遞呈CRISPR靶向細(xì)菌染色體的策略進(jìn)行殺菌,缺少靶向質(zhì)粒策略抗耐藥菌效果的深入分析,尤其缺少體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。其次,當(dāng)前研究顯示的噬菌體遞呈CRISPR技術(shù)殺菌效力有限,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的烈性噬菌體殺菌技術(shù),達(dá)不到實(shí)用水平。另外,噬菌體包裝技術(shù)需要改進(jìn)以避免抗性篩選標(biāo)記被引入包裝后的噬菌體基因組,并提高包裝噬菌體的效率和對(duì)新噬菌體的適用性。最后,以往研究只評(píng)價(jià)了1~2天內(nèi)包裝CRISPR-Cas噬菌體的抗菌能力,還需要在更長(zhǎng)的觀測(cè)時(shí)間里進(jìn)行持續(xù)觀測(cè)和分析。研究目的:細(xì)菌耐藥性主要由耐藥質(zhì)粒進(jìn)行介導(dǎo)和傳播。利用原核CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)清除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒,能夠恢復(fù)抗生素的殺菌效力,并阻斷細(xì)菌耐藥性的傳播。利用更加高效的原核載體技術(shù),攜帶靶向細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的CRISPR-Cas9系統(tǒng)更加高效的向耐藥菌遞呈,將大大增加該系統(tǒng)在抗耐藥菌領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用潛力。本研究將建立CRISPR-Cas9高效清除細(xì)菌耐藥性技術(shù)。設(shè)計(jì)并構(gòu)建特異性CRISPR-Cas9系統(tǒng)來分析靶向清除NDM-1耐藥質(zhì)粒的效果。在此基礎(chǔ)上,我們利用溫和噬菌體作為CRISPR-Cas9系統(tǒng)的高效遞呈載體。通過研發(fā)新型溫和噬菌體包裝CRISPR-Cas9技術(shù),實(shí)現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)的“一步法”包裝,探索從溫和噬菌體分離到完成包裝的技術(shù)流程。利用噬菌體遞呈CRISPR-Cas9系統(tǒng),在一系列的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)細(xì)菌耐藥性的清除效率,并分析聯(lián)合抗生素抗耐藥菌策略。通過持續(xù)監(jiān)測(cè)對(duì)耐藥菌生長(zhǎng)的抑制效果,分析噬菌體遞呈CRISPR-Cas9抗菌策略是否能避免新的細(xì)菌耐受突變的產(chǎn)生,是否具有比烈性噬菌體直接殺菌策略更加持久的抑菌效力。研究方法:建立針對(duì)超級(jí)耐藥基因bla_(NDM-1)的CRISPR-Cas9靶點(diǎn)spacer文庫(kù),構(gòu)建靶向NDM-1質(zhì)粒的CRISPR-Cas9系統(tǒng)質(zhì)粒。構(gòu)建攜帶NDM-1質(zhì)粒的耐藥大腸桿菌模型,采用定量PCR及熒光信號(hào)檢測(cè)等方法分析CRISPR-Cas9系統(tǒng)清除NDM-1質(zhì)粒的效率,藥敏實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)?zāi)退庂|(zhì)粒清除后細(xì)菌耐藥表型的變化。通過上述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CRISPR-Cas9系統(tǒng)高效清除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的能力。設(shè)計(jì)引入抗性篩選的新型重組噬菌體篩選系統(tǒng),建立“一步法”溫和噬菌體整合CRISPR-Cas9技術(shù)。采用該包裝技術(shù)改造一株新分離的大腸桿菌溫和噬菌體,使其遞呈CRISPR-Cas9系統(tǒng),并靶向剪切攜帶bla_(NDM-1)靶點(diǎn)的質(zhì)粒。利用包裝CRISPR-Cas9噬菌體侵染攜帶靶質(zhì)粒的大腸桿菌,分析噬菌體遞呈的CRISPR-Cas9系統(tǒng)清除細(xì)菌耐藥性的能力,包括PCR檢測(cè)靶質(zhì)粒的清除效果,定量PCR分析靶質(zhì)粒清除效率,菌落計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)耐藥細(xì)菌的敏感化率。利用包裝CRISPR-Cas9噬菌體介入細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、接合等水平轉(zhuǎn)移途徑,評(píng)價(jià)噬菌體遞呈CRISPR-Cas9系統(tǒng)清除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒在阻斷細(xì)菌耐藥性傳播擴(kuò)散方面的效果。建立溫和噬菌體遞呈CRISPR-Cas9聯(lián)合抗生素的抗耐藥菌策略,在包括生物膜、小鼠皮膚感染模型、小鼠腸道感染模型等體內(nèi)外條件下檢驗(yàn)該策略的耐藥性清除及耐藥菌殺滅效力。對(duì)聯(lián)合抗耐藥菌策略的殺菌效力進(jìn)行至少1周時(shí)間內(nèi)的連續(xù)監(jiān)測(cè),觀察是否會(huì)出現(xiàn)細(xì)菌對(duì)該策略的耐受突變,并和烈性噬菌體直接殺菌策略的耐受突變相比較。采用全基因組測(cè)序分析細(xì)菌產(chǎn)生噬菌體耐受突變的機(jī)制。研究結(jié)果:(1)建立了針對(duì)bla_(NDM-1)基因的CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶點(diǎn)文庫(kù),包含20條特異性spacer序列。構(gòu)建了靶向剪切bla_(NDM-1)基因的特異性原核CRISPR-Cas9系統(tǒng)質(zhì)粒。(2)利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)清除大腸桿菌的NDM-1質(zhì)粒,使產(chǎn)NDM-1耐藥模式菌變?yōu)閎la_(NDM-1)陰性,恢復(fù)細(xì)菌對(duì)亞胺培南及其它β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性。(3)證明原核CRISPR-Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)化耐藥菌可以高效清除大腸桿菌中攜帶的NDM-1質(zhì)粒。證明無論是天然的NDM-1大質(zhì)粒還是重組NDM-1高拷貝質(zhì)粒均可以在12 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)大于99%的細(xì)胞內(nèi)清除率。(4)建立了新的噬菌體包裝CRISPR-Cas9技術(shù),首次探索完成了大腸桿菌溫和噬菌體從分離測(cè)序到“一步法”包裝CRISPR-Cas9系統(tǒng)的整套技術(shù)流程。(5)檢驗(yàn)了噬菌體遞呈CRISPR-Cas9系統(tǒng)在體外條件下清除靶質(zhì)粒的效率,發(fā)現(xiàn)在8小時(shí)內(nèi)能實(shí)現(xiàn)大于99%的耐藥質(zhì)粒清除率。提出利用噬菌體遞呈CRISPR-Cas9清除細(xì)菌耐藥性聯(lián)合抗生素殺死耐藥菌的策略,在體外實(shí)驗(yàn)中降低了約10~6倍的耐藥大腸桿菌數(shù)量,優(yōu)于已報(bào)道研究中所采用的細(xì)菌染色體靶向策略。(6)噬菌體遞呈CRISPR-Cas9抗菌技術(shù)能夠減少細(xì)菌耐藥質(zhì)粒在環(huán)境中的釋放和積累,相比烈性噬菌體在8小時(shí)內(nèi)減少了約98.7%的耐藥質(zhì)粒釋放。噬菌體遞呈CRISPR-Cas9抗菌技術(shù)可阻斷耐藥質(zhì)粒在細(xì)菌間的接合轉(zhuǎn)移,減少了98%的pNDM-1接合子菌落數(shù)量,抑制細(xì)菌耐藥性的傳播擴(kuò)散。(7)首次在形成生物膜的耐藥菌中評(píng)價(jià)噬菌體遞呈CRISPR系統(tǒng)技術(shù),并證明該技術(shù)能夠在成熟生物膜中清除約50%的耐藥質(zhì)粒,將抗生素的最低生物膜清除濃度降低50%。(8)首次在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中評(píng)價(jià)CRISPR靶向細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的策略,噬菌體遞呈CRISPR系統(tǒng)能夠在小鼠皮膚感染模型和小鼠腸道感染模型中發(fā)揮清除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的作用并聯(lián)合抗生素實(shí)現(xiàn)10~5~10~6倍的耐藥大腸桿菌數(shù)的降低,效果優(yōu)于已報(bào)道的CRISPR靶向細(xì)菌染色體策略。(9)在體外條件下進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間殺菌效果監(jiān)測(cè),烈性噬菌體殺菌策略在24小時(shí)內(nèi)快速引發(fā)細(xì)菌的噬菌體耐受現(xiàn)象。而192小時(shí)內(nèi)未觀察到細(xì)菌對(duì)包裝CRISPR-Cas9噬菌體聯(lián)合抗生素殺菌策略的新耐受現(xiàn)象。體內(nèi)條件下,在小鼠皮膚和腸道耐藥菌感染模型中持續(xù)監(jiān)測(cè)該策略,烈性噬菌體策略在2-3天內(nèi)出現(xiàn)細(xì)菌的耐受,而7天內(nèi)未觀察到細(xì)菌對(duì)包裝CRISPR-Cas9噬菌體聯(lián)合抗生素殺菌策略的耐受。(10)通過對(duì)耐受突變株的全基因組測(cè)序,揭示大腸桿菌MG1655形成烈性噬菌體vB_253耐受的機(jī)制是在fepA基因位點(diǎn)出現(xiàn)堿基突變;大腸桿菌MG1655形成卡那霉素耐受的機(jī)制是在fusA基因位點(diǎn)出現(xiàn)堿基突變。而噬菌體遞呈CRISPR-Cas9系統(tǒng)清除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒聯(lián)合抗生素殺菌的策略不會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)上述基因突變。研究結(jié)論:本研究提出了利用噬菌體遞呈CRISPR-Cas9系統(tǒng)清除細(xì)菌耐藥性的策略。在方法學(xué)上新建了溫和噬菌體“一步法”包裝CRISPR-Cas9系統(tǒng)技術(shù)。利用噬菌體遞呈CRISPR-Cas9系統(tǒng)高效靶向清除細(xì)菌耐藥質(zhì)粒的策略,破壞了介導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的質(zhì)粒,阻斷細(xì)菌耐藥性的傳播,降低菌群環(huán)境中的耐藥基因水平,具備開發(fā)成為細(xì)菌耐藥性防控新技術(shù)的潛力。在耐藥菌治療方面,噬菌體遞呈CRISPR-Cas9清除細(xì)菌耐藥性并聯(lián)合應(yīng)用抗生素在體內(nèi)外一系列實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)了強(qiáng)大的殺滅耐藥菌能力。該策略不僅解決了由耐藥基因介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥性問題,使失效的抗生素療法重新煥發(fā)生機(jī),還避免了殺菌過程中可能出現(xiàn)的耐受突變,有望成為一種有效殺滅耐藥菌的新方法,在抗耐藥菌領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R378
【圖文】：

在不同菌株和菌種間傳播。以介導(dǎo)耐受碳該基因在 2010 年被首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)，同年的不動(dòng)桿菌，并發(fā)現(xiàn)該基因定位于可移現(xiàn)，產(chǎn) NDM-1 菌在我國(guó)醫(yī)院臨床、環(huán)境位于可移動(dòng)質(zhì)粒，并且涉及了多種質(zhì)粒類藥基因的跨菌種快速傳播。因此，清除細(xì)性，又可以破壞耐藥基因的傳播載體，進(jìn)菌的治療和防控。術(shù)的發(fā)展為研究人員提供了高效便捷的基領(lǐng)域也得到了廣泛應(yīng)用[33]。利用 CRISP細(xì)菌基因位點(diǎn)，并使 DNA 發(fā)生雙鏈斷裂斷裂的 DNA 雙鏈在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)核酸酶的們的研究將 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)設(shè)定為靶向耐受碳青酶烯類抗生素的 NDM-1 質(zhì)粒[34藥菌的敏感化，見圖 1.1。

軍事科學(xué)院博士學(xué)位論文中 blaNDM-1和 cas9 基因。見圖 1.1 a，每個(gè)質(zhì)粒挑選 個(gè)轉(zhuǎn)化菌落作展示，粒的轉(zhuǎn)化子中均檢測(cè)不到 blaNDM-1基因。挑選pCas9-T1質(zhì)粒進(jìn) 步分析清除pNDM-1的細(xì)菌占總細(xì)菌比例，并以pC粒載體轉(zhuǎn)化組對(duì)照。分別從轉(zhuǎn)化了 pCas9-T1 的實(shí)驗(yàn)組平板和轉(zhuǎn)化 pCas9 空照組的平板上挑選 15 個(gè)單菌落，blaNDM-1基因的陽性情況如圖 1.1 所示：實(shí)15 個(gè)菌落全部呈 blaNDM-1陰性，表明經(jīng) Cas9 核酸酶的特異性剪切后，該基因 PCR 擴(kuò)增。在挑選的 15 個(gè)轉(zhuǎn)化子中剪切成功率為 100%。而對(duì)照組 Cas9缺少 gRNA 的引導(dǎo)作用，未對(duì) blaNDM-1 進(jìn)行特異性切割。采用三對(duì)引NDM-F/NDM-R，NDM(Sal)-F/NDM(Xba)-R，NDM3-F/NDM3-R）再次驗(yàn)as9-T1 實(shí)驗(yàn)組中大腸桿菌單菌落攜帶 blaNDM-1 情況，PCR 結(jié)果均表明特異ISPR 系統(tǒng)能夠剪切破壞 blaNDM-1基因。

第 22 頁圖 1.3 J53 模式菌耐藥表型的轉(zhuǎn)變a：Etest 試紙條檢測(cè)金屬酶表達(dá)情況b：Etest 試紙條檢測(cè)亞胺培南 MIC 值c：亞胺培南 MIC 值統(tǒng)計(jì)分析1.3.4 CRISPR 系統(tǒng)剪切清除 pNDM-1 效率的分析對(duì)耐藥質(zhì)粒的清除效率關(guān)系到 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)清除耐藥質(zhì)粒技術(shù)的實(shí)性，也能給細(xì)菌敏感化后的抗生素聯(lián)用時(shí)機(jī)提供參考。本研究深入分析了 pCas9-T清除 J53 細(xì)胞內(nèi) pNDM-1 的效率。采用定量 PCR（quantitative PCR，qPCR）的法，以 16S 基因?yàn)閮?nèi)參，計(jì)算轉(zhuǎn)化 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)后第 2、4、8、16 和 32 小等時(shí)間點(diǎn)上 pNDM-1 拷貝量的變化，見圖 1.3。定量分析發(fā)現(xiàn)，CRISPR 系統(tǒng)清pNDM-1 速度極快，在 2 小時(shí)即清除了約 50%的耐藥質(zhì)粒，在 8 小時(shí)即實(shí)現(xiàn)了于 99.9%的清除效率，并且耐藥質(zhì)粒的清除作用 直持續(xù)到第 32 小時(shí)。雖pNDM-1 質(zhì)粒有潛在的恢復(fù)自身拷貝的可能，但經(jīng)本實(shí)驗(yàn)證實(shí) CRISPR 清

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本文編號(hào)：2800717