【摘要】：本論文分為兩個部分：(1)接頭蛋白TAB2信使RNA通過microRNA-155調(diào)節(jié)巨噬細胞內(nèi)毒素耐受；(2)白細胞介素27抑制肥大細胞介導的免疫應答及其機制研究。第一部分接頭蛋白TAB2信使RNA通過microRNA-155調(diào)節(jié)巨噬細胞內(nèi)毒素耐受競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNAs, ceRNA)是近幾年新提出的一種RNA轉(zhuǎn)錄體之間的一種新的調(diào)控方式。擁有共同microRNA反應元件的RNA轉(zhuǎn)錄體通過競爭結(jié)合共同的microRNA從而調(diào)控彼此的翻譯。已有研究表明,ceRNA的調(diào)節(jié)方式參與多種基因?qū)δ[瘤發(fā)生的調(diào)控過程。但是ceRNA的調(diào)節(jié)機制是否在天然免疫應答和內(nèi)毒素耐受中發(fā)揮作用尚未報道。脂多糖(LPS)刺激巨噬細胞會上調(diào)microRNA-155 (miR-155)的表達,在內(nèi)毒素耐受過程中發(fā)揮作用,miR-155可以靶向LPS-TLR4信號通路中的多個分子,包括MyD88, TAB2, SOCS1, β-arrestin2和SHIP1等。我們檢測了在LPS刺激巨噬細胞后,上述幾個分子的表達豐度及其變化。發(fā)現(xiàn)TAB2 mRNA是在上述分子中表達最高的,也是變化最劇烈的。SOCS1是一個誘導性表達的基因,表達倍數(shù)有明顯增加。我們提出假設：這些分子之間會不會通過miR-155形成一個調(diào)控網(wǎng)絡在內(nèi)毒素耐受中發(fā)揮作用?我們通過一系列實驗,揭示了巨噬細胞中TLR4信號通路中接頭蛋白TAB2與TLR4通路的負向調(diào)節(jié)分子SOCS1,競爭結(jié)合miRNA-155, TAB2 mRNA可能以ceRNA的方式上調(diào)SOCS1的蛋白表達,從而在巨噬細胞內(nèi)毒素耐受過程中發(fā)揮精細調(diào)節(jié)作用。首先,構(gòu)建了TAB23'UTR穩(wěn)定過表達的小鼠巨噬RAW264.7細胞系,誘導內(nèi)毒素耐受的模型,與對照細胞相比,可以檢測到此細胞系中SOCS1蛋白的表達明顯上調(diào),而分泌的細胞因子IL-6和TNF-a水平相應的下降。用siRNA敲減RAW264.7中TAB2 mRNA的表達,檢測到SOCS1蛋白表達顯著下降,同時細胞上清中的IL-6和TNF-a的含量相應地升高。為了說明TAB2 mRNA調(diào)控SOCS1蛋白是依賴于miR-155,同時干擾miR-155和TAB2 mRNA的表達,在上述內(nèi)毒素耐受的細胞模型中則SOCS1的蛋白水平則無明顯變化。這說明,TAB2 mRNA除了作為信使RNA翻譯目的蛋白質(zhì)外,還可能在microRNA的調(diào)控網(wǎng)絡中發(fā)揮作用,通過microRNA去間接調(diào)控其他基因的蛋白水平。上述實驗結(jié)果提示,在內(nèi)毒素耐受的巨噬細胞中,TAB2mRNA通過競爭結(jié)合miRNA-155,導致結(jié)合到SOCS1mRNA上的miR-155減少,從而上調(diào)SOCS1蛋白的表達,從而在內(nèi)毒素耐受中的調(diào)控中發(fā)揮作用。上述研究初步揭示了ceRNA可能是參與內(nèi)毒素耐受調(diào)控的一種新的方式,為深入研究內(nèi)毒素耐受的機制提供了新的認識,也可能為感染性疾病的診斷和治療提供新的思路。第二部分白細胞介素27抑制肥大細胞介導的免疫應答及其機制研究白細胞介素27(Interleukin27,IL-27)最初是作為可以促進Thl型應答而被認知的一種細胞因子,而隨后的研究證明IL-27具有重要的抑制炎癥的功能。肥大細胞是介導過敏反應的主要效應細胞,也是1gE相關(guān)疾病主要的效應細胞。我們前期實驗發(fā)現(xiàn),IL-27處理后肥大細胞表面IL-27受體亞基WSX-1和gp130的表達上調(diào),WSX-1缺陷的小鼠來源的肥大細胞對IgE觸發(fā)的應答增強,提示IL-27可能對肥大細胞的功能具有調(diào)控作用。本研究的目的是研究IL-27對肥大細胞介導的免疫應答的抑制效應及其相關(guān)機制。我們利用WSX-1缺陷和野生型的小鼠,建立了肥大細胞活化為主的三個疾病模型：被動性全身超敏反應、被動皮膚過敏反應和慢性氣道炎癥模型。結(jié)果顯示：與野生型(WT)小鼠比較,IL-27受體亞基WSX-1缺陷的小鼠(WSX-1-/-)的小鼠表現(xiàn)出更嚴重的全身性過敏反應和局部皮膚過敏反應,相應的血中組胺產(chǎn)生水平也升高。慢性氣道炎癥模型顯示：WSX-1-/-的小鼠肺臟中有更嚴重的炎性細胞的浸潤,以噬酸性細胞和杯狀細胞浸潤為主,WSX-1-/-的小鼠有更多的Th2型、炎性相關(guān)細胞因子包括IL-4,IL-5,IL-13等的分泌。在體外用重組IL-27處理WT和WSX-1-/-小鼠骨髓來源的肥大細胞,WSX-1-/-來源的肥大細胞分泌更多的Th2型和炎性相關(guān)的細胞因子,并且脫顆粒程度較之野生型小鼠來源的肥大細胞有明顯增加。與野生型(WT)小鼠相比,WSX-1-/-小鼠骨髓來源的活化的肥大細胞,其主要信號途徑Grb2/PLC-γ1-SLP-76和旁路信號通路P13K/Akt/IκBα,以及下游的MAPK和鈣離子流有明顯的增強,而且連接FcεRI受體和下游信號的關(guān)鍵分子lyn的磷酸化水平也明顯增強。我們的結(jié)論是：IL-27通過抑制PLC-γ/SLP-76信號通路和旁路信號通路負向調(diào)控肥大細胞介導的超敏反應和慢性炎癥反應。上述研究為揭示肥大細胞介導的免疫應答和機體維持免疫穩(wěn)態(tài)的調(diào)控分子機制提供了一定的依據(jù),也為深入研究白細胞介素27的生物學功能提供了新的認識,并可能為相關(guān)的過敏反應性疾病的診治提供啟示。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【圖文】：

ｍｉｍｉｃｓ共轉(zhuǎn)入ＨＫＥ－２９３細胞中，２４ｈ后測細胞裂解液的巧光素酶活性。結(jié)果顯示，逡逑ｍ化１５５ｍｉｍｉｃｓ能明顯降低巧光素酶的活性，并且突變ｍｉＲ－１５５種子序列后，報告逡逑基因的活性恢復，與轉(zhuǎn)染空載體的結(jié)果無顯著性差異（圖３．１）。逡逑上述結(jié)果表明，ｍｉＲＮＡ－１５５可１＾義乾向于ＴＡＢ２和Ｓ０ＣＳ１邋ｍＲＮＡ的３＂ＵＴＲ。逡逑２５－１逡逑？含邐＊逡逑Ｉ邋２０－邐＊邋Ｉ邋Ａ邐□邋ｍＷ－巧５逡逑ｉ邋巧－ｒＨ邋ｉ國邋Ａ邐ｎ邋ｍｉＲ－１５５邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑Ｉ逡逑ｐＭｌＲ邋ｅｍｐｔｙ邐ＴＡＢ２邐ＴＡＢ２逡逑３‘Ｕ下民邐３心Ｔ民ｍｕｔ逡逑會邐了邋＊邋■邋Ｉ邋ｆｒｉｆａ邐□邋ｍｉＲ－巧邋５逡逑－２０－產(chǎn)ｒｉｌ邋Ｉ邋■化＇逡逑■＊Ｔ邐■邋ｍ舊－巧邋５邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑■邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑ｉＭ－Ｗｌｍ逡逑ｐＭＩＲ邋ｅｍｐｔｙ邋ＳＯＣＳｌ邐ＳＯＣＳｌ逡逑３，ＵＴＲ邐３１ＵＴ民邋ｍｕｔ逡逑圖３．１邋ＳＯＣＳｌ和ＴＡＢ２是ｍｉＲ－１５５作用的輪點逡逑１０逡逑

ｍｉｍｉｃｓ共轉(zhuǎn)入ＨＫＥ－２９３細胞中，２４ｈ后測細胞裂解液的巧光素酶活性。結(jié)果顯示，逡逑ｍ化１５５ｍｉｍｉｃｓ能明顯降低巧光素酶的活性，并且突變ｍｉＲ－１５５種子序列后，報告逡逑基因的活性恢復，與轉(zhuǎn)染空載體的結(jié)果無顯著性差異（圖３．１）。逡逑上述結(jié)果表明，ｍｉＲＮＡ－１５５可１＾義乾向于ＴＡＢ２和Ｓ０ＣＳ１邋ｍＲＮＡ的３＂ＵＴＲ。逡逑２５－１逡逑？含邐＊逡逑Ｉ邋２０－邐＊邋Ｉ邋Ａ邐□邋ｍＷ－巧５逡逑ｉ邋巧－ｒＨ邋ｉ國邋Ａ邐ｎ邋ｍｉＲ－１５５邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑Ｉ逡逑ｐＭｌＲ邋ｅｍｐｔｙ邐ＴＡＢ２邐ＴＡＢ２逡逑３‘Ｕ下民邐３心Ｔ民ｍｕｔ逡逑會邐了邋＊邋■邋Ｉ邋ｆｒｉｆａ邐□邋ｍｉＲ－巧邋５逡逑－２０－產(chǎn)ｒｉｌ邋Ｉ邋■化＇逡逑■＊Ｔ邐■邋ｍ舊－巧邋５邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑■邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑ｉＭ－Ｗｌｍ逡逑ｐＭＩＲ邋ｅｍｐｔｙ邋ＳＯＣＳｌ邐ＳＯＣＳｌ逡逑３，ＵＴＲ邐３１ＵＴ民邋ｍｕｔ逡逑圖３．１邋ＳＯＣＳｌ和ＴＡＢ２是ｍｉＲ－１５５作用的輪點逡逑１０逡逑

髓來源的肥大細胞的形態(tài)和表面關(guān)鍵分子的表達。隨后的實驗我們要證明化大細逡逑胞表面是否表達比－２７的受體。民Ｔ－ＰＣＲ結(jié)栗顯示，化－２７受體在靜止的和Ｆｃｄｌｌ逡逑活化的骨髓來源的肥大細胞中均有表達（圖３N４Ａ）。流式細胞術(shù)結(jié)果也證明活化逡逑的肥大細胞表面表達更高水平的比－２７受體亞基ＷＳＸ－１和ｇｐＢＯ邋（圖３．１．４邋Ｂ邋），提逡逑示比－２７有可能對活化的肥大細胞發(fā)揮調(diào)控作用。逡逑Ａ邐ＤＮＰ－邋ＤＮＰ－逡逑ＰＢＳ邋ＢＳＡ邋ＰＢＳ邋ＢＳＡ逡逑■ＷｉｉＸ－１逡逑ＢＭＭＣ逡逑Ｂ逡逑ｂｌａｎｋ逡逑ｊ邋＼邐邐ｗｓｘ－１逡逑！邋＼邐刮，ｉ－；0逡逑ｃ邋！、‘’逡逑３邐！邐ｒｅｓｔ逡逑Ｓ邐／邐＼邐ＢＭＭＣ逡逑＜邐’邐．１、逡逑－Ｌ＾邐．邋Ｉ邋，邐，邋＿＇邋－逡逑化邐巧邐１０邐巧邐化0邐？邐巧Ｓ逡逑．尸逡逑！邋’＼逡逑？邋１邐ａｃｔｉｖａｔｅｄ逡逑／邐Ｖ邐ＢＭＭＣ逡逑‘心，、、—Ｉ邋１，．｜邋，１邐．邋Ｉ逡逑心．ｆｉ＇邐１３？邋Ｉｔ＇邐＇０，逡逑圖３．１．４忙－２７受體在肥大細胞中的表

本文編號：2800461