【摘要】：本論文分為兩個(gè)部分：(1)接頭蛋白TAB2信使RNA通過(guò)microRNA-155調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)毒素耐受；(2)白細(xì)胞介素27抑制肥大細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答及其機(jī)制研究。第一部分接頭蛋白TAB2信使RNA通過(guò)microRNA-155調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)毒素耐受競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNAs, ceRNA)是近幾年新提出的一種RNA轉(zhuǎn)錄體之間的一種新的調(diào)控方式。擁有共同microRNA反應(yīng)元件的RNA轉(zhuǎn)錄體通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合共同的microRNA從而調(diào)控彼此的翻譯。已有研究表明,ceRNA的調(diào)節(jié)方式參與多種基因?qū)δ[瘤發(fā)生的調(diào)控過(guò)程。但是ceRNA的調(diào)節(jié)機(jī)制是否在天然免疫應(yīng)答和內(nèi)毒素耐受中發(fā)揮作用尚未報(bào)道。脂多糖(LPS)刺激巨噬細(xì)胞會(huì)上調(diào)microRNA-155 (miR-155)的表達(dá),在內(nèi)毒素耐受過(guò)程中發(fā)揮作用,miR-155可以靶向LPS-TLR4信號(hào)通路中的多個(gè)分子,包括MyD88, TAB2, SOCS1, β-arrestin2和SHIP1等。我們檢測(cè)了在LPS刺激巨噬細(xì)胞后,上述幾個(gè)分子的表達(dá)豐度及其變化。發(fā)現(xiàn)TAB2 mRNA是在上述分子中表達(dá)最高的,也是變化最劇烈的。SOCS1是一個(gè)誘導(dǎo)性表達(dá)的基因,表達(dá)倍數(shù)有明顯增加。我們提出假設(shè)：這些分子之間會(huì)不會(huì)通過(guò)miR-155形成一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在內(nèi)毒素耐受中發(fā)揮作用?我們通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn),揭示了巨噬細(xì)胞中TLR4信號(hào)通路中接頭蛋白TAB2與TLR4通路的負(fù)向調(diào)節(jié)分子SOCS1,競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miRNA-155, TAB2 mRNA可能以ceRNA的方式上調(diào)SOCS1的蛋白表達(dá),從而在巨噬細(xì)胞內(nèi)毒素耐受過(guò)程中發(fā)揮精細(xì)調(diào)節(jié)作用。首先,構(gòu)建了TAB23'UTR穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的小鼠巨噬RAW264.7細(xì)胞系,誘導(dǎo)內(nèi)毒素耐受的模型,與對(duì)照細(xì)胞相比,可以檢測(cè)到此細(xì)胞系中SOCS1蛋白的表達(dá)明顯上調(diào),而分泌的細(xì)胞因子IL-6和TNF-a水平相應(yīng)的下降。用siRNA敲減RAW264.7中TAB2 mRNA的表達(dá),檢測(cè)到SOCS1蛋白表達(dá)顯著下降,同時(shí)細(xì)胞上清中的IL-6和TNF-a的含量相應(yīng)地升高。為了說(shuō)明TAB2 mRNA調(diào)控SOCS1蛋白是依賴于miR-155,同時(shí)干擾miR-155和TAB2 mRNA的表達(dá),在上述內(nèi)毒素耐受的細(xì)胞模型中則SOCS1的蛋白水平則無(wú)明顯變化。這說(shuō)明,TAB2 mRNA除了作為信使RNA翻譯目的蛋白質(zhì)外,還可能在microRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用,通過(guò)microRNA去間接調(diào)控其他基因的蛋白水平。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,在內(nèi)毒素耐受的巨噬細(xì)胞中,TAB2mRNA通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miRNA-155,導(dǎo)致結(jié)合到SOCS1mRNA上的miR-155減少,從而上調(diào)SOCS1蛋白的表達(dá),從而在內(nèi)毒素耐受中的調(diào)控中發(fā)揮作用。上述研究初步揭示了ceRNA可能是參與內(nèi)毒素耐受調(diào)控的一種新的方式,為深入研究?jī)?nèi)毒素耐受的機(jī)制提供了新的認(rèn)識(shí),也可能為感染性疾病的診斷和治療提供新的思路。第二部分白細(xì)胞介素27抑制肥大細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答及其機(jī)制研究白細(xì)胞介素27(Interleukin27,IL-27)最初是作為可以促進(jìn)Thl型應(yīng)答而被認(rèn)知的一種細(xì)胞因子,而隨后的研究證明IL-27具有重要的抑制炎癥的功能。肥大細(xì)胞是介導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞,也是1gE相關(guān)疾病主要的效應(yīng)細(xì)胞。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),IL-27處理后肥大細(xì)胞表面IL-27受體亞基WSX-1和gp130的表達(dá)上調(diào),WSX-1缺陷的小鼠來(lái)源的肥大細(xì)胞對(duì)IgE觸發(fā)的應(yīng)答增強(qiáng),提示IL-27可能對(duì)肥大細(xì)胞的功能具有調(diào)控作用。本研究的目的是研究IL-27對(duì)肥大細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的抑制效應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制。我們利用WSX-1缺陷和野生型的小鼠,建立了肥大細(xì)胞活化為主的三個(gè)疾病模型：被動(dòng)性全身超敏反應(yīng)、被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)和慢性氣道炎癥模型。結(jié)果顯示：與野生型(WT)小鼠比較,IL-27受體亞基WSX-1缺陷的小鼠(WSX-1-/-)的小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的全身性過(guò)敏反應(yīng)和局部皮膚過(guò)敏反應(yīng),相應(yīng)的血中組胺產(chǎn)生水平也升高。慢性氣道炎癥模型顯示：WSX-1-/-的小鼠肺臟中有更嚴(yán)重的炎性細(xì)胞的浸潤(rùn),以噬酸性細(xì)胞和杯狀細(xì)胞浸潤(rùn)為主,WSX-1-/-的小鼠有更多的Th2型、炎性相關(guān)細(xì)胞因子包括IL-4,IL-5,IL-13等的分泌。在體外用重組IL-27處理WT和WSX-1-/-小鼠骨髓來(lái)源的肥大細(xì)胞,WSX-1-/-來(lái)源的肥大細(xì)胞分泌更多的Th2型和炎性相關(guān)的細(xì)胞因子,并且脫顆粒程度較之野生型小鼠來(lái)源的肥大細(xì)胞有明顯增加。與野生型(WT)小鼠相比,WSX-1-/-小鼠骨髓來(lái)源的活化的肥大細(xì)胞,其主要信號(hào)途徑Grb2/PLC-γ1-SLP-76和旁路信號(hào)通路P13K/Akt/IκBα,以及下游的MAPK和鈣離子流有明顯的增強(qiáng),而且連接FcεRI受體和下游信號(hào)的關(guān)鍵分子lyn的磷酸化水平也明顯增強(qiáng)。我們的結(jié)論是：IL-27通過(guò)抑制PLC-γ/SLP-76信號(hào)通路和旁路信號(hào)通路負(fù)向調(diào)控肥大細(xì)胞介導(dǎo)的超敏反應(yīng)和慢性炎癥反應(yīng)。上述研究為揭示肥大細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和機(jī)體維持免疫穩(wěn)態(tài)的調(diào)控分子機(jī)制提供了一定的依據(jù),也為深入研究白細(xì)胞介素27的生物學(xué)功能提供了新的認(rèn)識(shí),并可能為相關(guān)的過(guò)敏反應(yīng)性疾病的診治提供啟示。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【圖文】：

ｍｉｍｉｃｓ共轉(zhuǎn)入ＨＫＥ－２９３細(xì)胞中，２４ｈ后測(cè)細(xì)胞裂解液的巧光素酶活性。結(jié)果顯示，逡逑ｍ化１５５ｍｉｍｉｃｓ能明顯降低巧光素酶的活性，并且突變ｍｉＲ－１５５種子序列后，報(bào)告逡逑基因的活性恢復(fù)，與轉(zhuǎn)染空載體的結(jié)果無(wú)顯著性差異（圖３．１）。逡逑上述結(jié)果表明，ｍｉＲＮＡ－１５５可１＾義乾向于ＴＡＢ２和Ｓ０ＣＳ１邋ｍＲＮＡ的３＂ＵＴＲ。逡逑２５－１逡逑？含邐＊逡逑Ｉ邋２０－邐＊邋Ｉ邋Ａ邐□邋ｍＷ－巧５逡逑ｉ邋巧－ｒＨ邋ｉ國(guó)邋Ａ邐ｎ邋ｍｉＲ－１５５邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑Ｉ逡逑ｐＭｌＲ邋ｅｍｐｔｙ邐ＴＡＢ２邐ＴＡＢ２逡逑３‘Ｕ下民邐３心Ｔ民ｍｕｔ逡逑會(huì)邐了邋＊邋■邋Ｉ邋ｆｒｉｆａ邐□邋ｍｉＲ－巧邋５逡逑－２０－產(chǎn)ｒｉｌ邋Ｉ邋■化＇逡逑■＊Ｔ邐■邋ｍ舊－巧邋５邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑■邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑ｉＭ－Ｗｌｍ逡逑ｐＭＩＲ邋ｅｍｐｔｙ邋ＳＯＣＳｌ邐ＳＯＣＳｌ逡逑３，ＵＴＲ邐３１ＵＴ民邋ｍｕｔ逡逑圖３．１邋ＳＯＣＳｌ和ＴＡＢ２是ｍｉＲ－１５５作用的輪點(diǎn)逡逑１０逡逑

ｍｉｍｉｃｓ共轉(zhuǎn)入ＨＫＥ－２９３細(xì)胞中，２４ｈ后測(cè)細(xì)胞裂解液的巧光素酶活性。結(jié)果顯示，逡逑ｍ化１５５ｍｉｍｉｃｓ能明顯降低巧光素酶的活性，并且突變ｍｉＲ－１５５種子序列后，報(bào)告逡逑基因的活性恢復(fù)，與轉(zhuǎn)染空載體的結(jié)果無(wú)顯著性差異（圖３．１）。逡逑上述結(jié)果表明，ｍｉＲＮＡ－１５５可１＾義乾向于ＴＡＢ２和Ｓ０ＣＳ１邋ｍＲＮＡ的３＂ＵＴＲ。逡逑２５－１逡逑？含邐＊逡逑Ｉ邋２０－邐＊邋Ｉ邋Ａ邐□邋ｍＷ－巧５逡逑ｉ邋巧－ｒＨ邋ｉ國(guó)邋Ａ邐ｎ邋ｍｉＲ－１５５邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑Ｉ逡逑ｐＭｌＲ邋ｅｍｐｔｙ邐ＴＡＢ２邐ＴＡＢ２逡逑３‘Ｕ下民邐３心Ｔ民ｍｕｔ逡逑會(huì)邐了邋＊邋■邋Ｉ邋ｆｒｉｆａ邐□邋ｍｉＲ－巧邋５逡逑－２０－產(chǎn)ｒｉｌ邋Ｉ邋■化＇逡逑■＊Ｔ邐■邋ｍ舊－巧邋５邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑■邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑ｉＭ－Ｗｌｍ逡逑ｐＭＩＲ邋ｅｍｐｔｙ邋ＳＯＣＳｌ邐ＳＯＣＳｌ逡逑３，ＵＴＲ邐３１ＵＴ民邋ｍｕｔ逡逑圖３．１邋ＳＯＣＳｌ和ＴＡＢ２是ｍｉＲ－１５５作用的輪點(diǎn)逡逑１０逡逑

髓來(lái)源的肥大細(xì)胞的形態(tài)和表面關(guān)鍵分子的表達(dá)。隨后的實(shí)驗(yàn)我們要證明化大細(xì)逡逑胞表面是否表達(dá)比－２７的受體。民Ｔ－ＰＣＲ結(jié)栗顯示，化－２７受體在靜止的和Ｆｃｄｌｌ逡逑活化的骨髓來(lái)源的肥大細(xì)胞中均有表達(dá)（圖３N４Ａ）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也證明活化逡逑的肥大細(xì)胞表面表達(dá)更高水平的比－２７受體亞基ＷＳＸ－１和ｇｐＢＯ邋（圖３．１．４邋Ｂ邋），提逡逑示比－２７有可能對(duì)活化的肥大細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用。逡逑Ａ邐ＤＮＰ－邋ＤＮＰ－逡逑ＰＢＳ邋ＢＳＡ邋ＰＢＳ邋ＢＳＡ逡逑■ＷｉｉＸ－１逡逑ＢＭＭＣ逡逑Ｂ逡逑ｂｌａｎｋ逡逑ｊ邋＼邐邐ｗｓｘ－１逡逑！邋＼邐刮，ｉ－；0逡逑ｃ邋！、‘’逡逑３邐！邐ｒｅｓｔ逡逑Ｓ邐／邐＼邐ＢＭＭＣ逡逑＜邐’邐．１、逡逑－Ｌ＾邐．邋Ｉ邋，邐，邋＿＇邋－逡逑化邐巧邐１０邐巧邐化0邐？邐巧Ｓ逡逑．尸逡逑！邋’＼逡逑？邋１邐ａｃｔｉｖａｔｅｄ逡逑／邐Ｖ邐ＢＭＭＣ逡逑‘心，、、—Ｉ邋１，．｜邋，１邐．邋Ｉ逡逑心．ｆｉ＇邐１３？邋Ｉｔ＇邐＇０，逡逑圖３．１．４忙－２７受體在肥大細(xì)胞中的表

本文編號(hào)：2800461