發(fā)布時(shí)間：2020-08-22 02:43

【摘要】：在腦連接組學(xué),尤其是腦疾病異常神經(jīng)回路連接的研究中,高爾基染色作為經(jīng)典的標(biāo)記工具,它仍是當(dāng)前靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物大腦,以及人腦標(biāo)記中最為常用的手段。被高爾基方法染色的樣本在制備中通常需要使用切片機(jī)將毫米厚的腦組織切成微米厚的腦片,但是,受到振動(dòng)切片機(jī)或冰凍切片機(jī)切削厚度的影響,用于腦神經(jīng)元成像的腦片厚度局限在10微米以上。在寬場(chǎng)或共聚焦顯微鏡中,腦片過(guò)厚會(huì)導(dǎo)致三維數(shù)據(jù)重建存在一定的缺斷或不完整性。而刀面掃描顯微鏡雖然可以進(jìn)行1微米厚度的切片成像,但是存在成像速度慢的缺點(diǎn)。因此,發(fā)展基于高爾基染色全腦的三維快速層析成像方法成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。 高爾基染色被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)元的標(biāo)記中,但是對(duì)其染色機(jī)制,一直未得到準(zhǔn)確的解釋。對(duì)Golgi-Cox染色神經(jīng)元上析出物的分析,是解釋其染色機(jī)制的物質(zhì)基礎(chǔ)。但是,由于傳統(tǒng)光學(xué)成像手段,如寬場(chǎng)透射成像和共聚焦反射成像,存在不能進(jìn)行成分分析的缺點(diǎn),而其它化學(xué)檢測(cè)手段存在不能準(zhǔn)確定位到被染色神經(jīng)元,或不能提出被染神經(jīng)元上的析出物的缺點(diǎn),從而導(dǎo)致對(duì)高爾基染色后神經(jīng)元上析出物的成分分析存在困難。因此,采用新的成像方法,并結(jié)合多種表征手段對(duì)Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元的析出物進(jìn)行成分分析,可以研究Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元的機(jī)制。 本文旨在探索適合Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元的熒光成像方法,并結(jié)合多種表征手段對(duì)被染神經(jīng)元上的物質(zhì)進(jìn)行成分研究,拓展高爾基標(biāo)記腦神經(jīng)元的應(yīng)用,并促進(jìn)對(duì)高爾基染色機(jī)制的理解。 首先,本文研究了Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元的單光子熒光成像方法。本文對(duì)經(jīng)改良的Golgi-Cox染色法制備全腦樣品的背景進(jìn)行熒光光譜分析,提出Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元的熒光成像原理。通過(guò)Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元的共聚焦熒光成像和寬場(chǎng)熒光成像的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了原理。通過(guò)對(duì)比熒光成像方法與經(jīng)典的寬場(chǎng)透射成像方法,發(fā)現(xiàn)熒光成像能抑制背景干擾。該熒光成像方法在Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元的研究中能區(qū)分已染色神經(jīng)元和未染神經(jīng)元的胞體。 接著,本文將Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元的寬場(chǎng)熒光成像拓展為了寬場(chǎng)熒光層析成像。根據(jù)寬場(chǎng)熒光顯微鏡和“先成像后切片”的成像策略,論證了寬場(chǎng)熒光層析成像的可行性。通過(guò)對(duì)采集的數(shù)據(jù)結(jié)合算法處理,本文獲得了Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元寬場(chǎng)熒光層析的三維圖像。 隨后,本文通過(guò)雙光子熒光成像觀察到Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元的雙光子熒光現(xiàn)象及熒光特性。并結(jié)合顯微紅外光譜探討了Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元發(fā)射熒光的機(jī)理。結(jié)合掃描電子顯微鏡、環(huán)境掃描電子顯微鏡、X射線能譜分析、X射線光電子能譜分析,本文對(duì)Golgi-Cox染色神經(jīng)元上的析出物進(jìn)行形貌、元素以及價(jià)態(tài)、官能團(tuán)的分析,得出析出物的成分,推測(cè)出汞蛋白與Golgi-Cox染色機(jī)制的關(guān)聯(lián)和Golgi-Cox染色堿化過(guò)程前后的析出物。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R338

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本文編號(hào)：2800167