【摘要】：在腦連接組學(xué),尤其是腦疾病異常神經(jīng)回路連接的研究中,高爾基染色作為經(jīng)典的標(biāo)記工具,它仍是當(dāng)前靈長類動物大腦,以及人腦標(biāo)記中最為常用的手段。被高爾基方法染色的樣本在制備中通常需要使用切片機將毫米厚的腦組織切成微米厚的腦片,但是,受到振動切片機或冰凍切片機切削厚度的影響,用于腦神經(jīng)元成像的腦片厚度局限在10微米以上。在寬場或共聚焦顯微鏡中,腦片過厚會導(dǎo)致三維數(shù)據(jù)重建存在一定的缺斷或不完整性。而刀面掃描顯微鏡雖然可以進行1微米厚度的切片成像,但是存在成像速度慢的缺點。因此,發(fā)展基于高爾基染色全腦的三維快速層析成像方法成為當(dāng)前研究的熱點。 高爾基染色被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)元的標(biāo)記中,但是對其染色機制,一直未得到準(zhǔn)確的解釋。對Golgi-Cox染色神經(jīng)元上析出物的分析,是解釋其染色機制的物質(zhì)基礎(chǔ)。但是,由于傳統(tǒng)光學(xué)成像手段,如寬場透射成像和共聚焦反射成像,存在不能進行成分分析的缺點,而其它化學(xué)檢測手段存在不能準(zhǔn)確定位到被染色神經(jīng)元,或不能提出被染神經(jīng)元上的析出物的缺點,從而導(dǎo)致對高爾基染色后神經(jīng)元上析出物的成分分析存在困難。因此,采用新的成像方法,并結(jié)合多種表征手段對Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元的析出物進行成分分析,可以研究Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元的機制。 本文旨在探索適合Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元的熒光成像方法,并結(jié)合多種表征手段對被染神經(jīng)元上的物質(zhì)進行成分研究,拓展高爾基標(biāo)記腦神經(jīng)元的應(yīng)用,并促進對高爾基染色機制的理解。 首先,本文研究了Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元的單光子熒光成像方法。本文對經(jīng)改良的Golgi-Cox染色法制備全腦樣品的背景進行熒光光譜分析,提出Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元的熒光成像原理。通過Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元的共聚焦熒光成像和寬場熒光成像的實驗驗證了原理。通過對比熒光成像方法與經(jīng)典的寬場透射成像方法,發(fā)現(xiàn)熒光成像能抑制背景干擾。該熒光成像方法在Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元的研究中能區(qū)分已染色神經(jīng)元和未染神經(jīng)元的胞體。 接著,本文將Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元的寬場熒光成像拓展為了寬場熒光層析成像。根據(jù)寬場熒光顯微鏡和“先成像后切片”的成像策略,論證了寬場熒光層析成像的可行性。通過對采集的數(shù)據(jù)結(jié)合算法處理,本文獲得了Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元寬場熒光層析的三維圖像。 隨后,本文通過雙光子熒光成像觀察到Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元的雙光子熒光現(xiàn)象及熒光特性。并結(jié)合顯微紅外光譜探討了Golgi-Cox染色鼠腦神經(jīng)元發(fā)射熒光的機理。結(jié)合掃描電子顯微鏡、環(huán)境掃描電子顯微鏡、X射線能譜分析、X射線光電子能譜分析,本文對Golgi-Cox染色神經(jīng)元上的析出物進行形貌、元素以及價態(tài)、官能團的分析,得出析出物的成分,推測出汞蛋白與Golgi-Cox染色機制的關(guān)聯(lián)和Golgi-Cox染色堿化過程前后的析出物。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R338

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本文編號：2800167