【摘要】：研究背景我國(guó)每年新生兒出生缺陷率為5.6%左右,出生缺陷的病因復(fù)雜,遺傳因素和環(huán)境因素均可導(dǎo)致出生缺陷的發(fā)生。妊娠期微生物感染是環(huán)境因素主要種類之一,金黃色葡萄球菌(金葡菌,S.aureus)是細(xì)菌感染性疾病中最常見(jiàn)的病原菌之一,也是導(dǎo)致孕婦不良妊娠結(jié)局及胎兒發(fā)育異常的重要因素。葡萄球菌腸毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)為金葡菌的重要致病物質(zhì)之一,既是一種毒素性致病物質(zhì),也是超抗原家族中最常見(jiàn)、最重要的一種超抗原。導(dǎo)師課題組前期研究發(fā)現(xiàn),妊娠期孕鼠給予SEB可明顯影響子代鼠中樞及外周CD4/CD8T細(xì)胞的構(gòu)成比例,但有關(guān)妊娠期孕鼠給予SEB對(duì)子代鼠T細(xì)胞起平衡調(diào)節(jié)作用的CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg細(xì)胞(以下統(tǒng)稱“Treg細(xì)胞”)影響的研究,國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。本項(xiàng)目擬研究妊娠期孕鼠給予SEB對(duì)新生及成年子代鼠胸腺及外周血Treg細(xì)胞的影響,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)子代鼠胸腺及外周血中Treg細(xì)胞的數(shù)量;用ELISA法檢測(cè)外周血中IL-10和TGF-β的含量;用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)FoxP3的mRNA和蛋白水平。其結(jié)果將為探討SEB與有關(guān)免疫性疾病的發(fā)生機(jī)理關(guān)系、提高人口健康和出生質(zhì)量具有極其重要的價(jià)值。目的研究妊娠期孕鼠注射SEB對(duì)其子代鼠胸腺及外周血中Treg細(xì)胞的影響。方法1.建立妊娠期孕鼠模型及注射SEB成年雌雄SD大鼠(雌性約50只,雄性約20只)按1:1比例于18:00合籠,次日發(fā)現(xiàn)陰栓后即認(rèn)為雌鼠已受孕,記為妊娠第一天(gestational day 1,GD1)。在GD16,孕鼠隨機(jī)分為兩組,實(shí)驗(yàn)組孕鼠通過(guò)尾靜脈注射0.3ml 50μg/ml SEB,對(duì)照組給予同等體積的PBS,然后讓孕鼠繼續(xù)妊娠至孕期滿,待自然分娩后,取一部分新生子代鼠進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究,另一部分讓其繼續(xù)生長(zhǎng)至成年期進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究。2.實(shí)驗(yàn)分組2.1在新生子代鼠研究中,分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組為GD16給予SEB注射的孕鼠分娩得到的新生子代鼠,標(biāo)記為“新生鼠SEB組”。對(duì)照組為給予同等體積PBS注射的孕鼠分娩得到的新生子代鼠,標(biāo)記為“新生鼠PBS組”。2.2在成年子代鼠研究中,分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組為妊娠期注射SEB孕鼠所產(chǎn)的成年子代鼠,標(biāo)記為“成年鼠SEB組”;對(duì)照組為妊娠期注射同等體積PBS孕鼠所產(chǎn)的成年子代鼠,標(biāo)記為“成年鼠PBS組”。2.3在成年子代鼠再次應(yīng)答的研究中,分為四組。妊娠期給予PBS注射的孕鼠所產(chǎn)的成年子代鼠,在成年期分別再次給予PBS或SEB注射,相應(yīng)記為“PBS+PBS組”及“PBS+SEB組”。妊娠期給予SEB注射的孕鼠所產(chǎn)的成年子代鼠,在成年期分別再次給予PBS或SEB注射,相應(yīng)記為“SEB+PBS組”及“SEB+SEB組”。3.妊娠期孕鼠注射SEB對(duì)新生子代鼠Treg細(xì)胞的影響研究3.1妊娠期孕鼠注射SEB對(duì)新生子代鼠胸腺和外周血Treg細(xì)胞數(shù)量的影響研究妊娠期孕鼠注射SEB,在新生子代鼠出生后第1、3、5天,取其胸腺制成單細(xì)胞懸液,并獲取外周血,用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞,用熒光標(biāo)記的抗體(CD3-FITC,CD4-APC,CD25-PE,FoxP3-percy5.5)進(jìn)行胞內(nèi)外染色后,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其胸腺和外周血中Treg細(xì)胞的比例,并計(jì)算Treg細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。3.2妊娠期孕鼠注射SEB對(duì)新生子代鼠第五天外周血中細(xì)胞因子的影響研究孕鼠于妊娠期注射SEB,待其自然分娩,在新生子代鼠出生后第5天斷頭獲取其抗凝血液,離心得到血漿,通過(guò)ELISA法測(cè)定IL-10和TGF-β的含量。3.3妊娠期孕鼠注射SEB對(duì)新生子代鼠FoxP3蛋白及mRNA水平的影響研究獲得新生子代鼠胸腺及外周血單個(gè)核細(xì)胞,抽提其總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過(guò)real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞中FoxP3的mRNA水平;提取樣本中的總蛋白,采用western blot定量檢測(cè)FoxP3蛋白表達(dá)水平。4.妊娠期孕鼠注射SEB對(duì)成年子代鼠Treg細(xì)胞的影響研究4.1妊娠期孕鼠注射SEB對(duì)成年子代鼠胸腺和外周血Treg細(xì)胞數(shù)量的影響研究妊娠期孕鼠注射SEB后,待其新生子代鼠生長(zhǎng)至成年(3-5個(gè)月),取其胸腺制成單細(xì)胞懸液,并獲取外周血,用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞,用熒光抗體(CD3-FITC,CD4-APC,CD25-PE,FoxP3-percy5.5)染色后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg細(xì)胞的比例,并計(jì)算Treg細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。4.2妊娠期孕鼠注射SEB對(duì)成年子代鼠外周血中細(xì)胞因子的影響研究孕鼠于妊娠期注射SEB,待新生子代鼠生長(zhǎng)至成年后,抽取腹主動(dòng)脈血液并抗凝,離心獲得血漿,通過(guò)ELISA法測(cè)定IL-10和TGF-β的含量。4.3妊娠期孕鼠注射SEB對(duì)成年子代鼠FoxP3蛋白及mRNA水平的影響研究獲得成年子代鼠胸腺及外周血單個(gè)核細(xì)胞,抽提其總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過(guò)real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞中FoxP3的mRNA水平;提取樣本中的總蛋白,采用western blot定量檢測(cè)FoxP3蛋白表達(dá)水平。5.再次給予SEB對(duì)成年子代鼠Treg細(xì)胞的影響研究妊娠期給予SEB或PBS孕鼠的成年子代鼠,分別再次給予SEB或PBS尾靜脈注射,5天后獲取成年子代鼠的胸腺和外周血進(jìn)行如下研究。5.1再次給予SEB對(duì)成年子代鼠胸腺和外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量的影響研究淋巴細(xì)胞分離液分離胸腺及外周血單個(gè)核細(xì)胞,通過(guò)熒光標(biāo)記的抗體(CD3-FITC,CD4-APC,CD25-PE,FoxP3-percy5.5)進(jìn)行胞內(nèi)外染色,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其Treg細(xì)胞的比例,并計(jì)算Treg細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。5.2再次給予SEB對(duì)成年子代鼠外周血中細(xì)胞因子的影響研究抗凝的外周血離心后得到血漿,通過(guò)ELISA法測(cè)定成年子代鼠外周血中IL-10和TGF-β的含量。5.3再次給予SEB對(duì)成年子代鼠胸腺和外周血中FoxP3蛋白及mRNA水平的影響研究淋巴細(xì)胞分離液分離成年子代鼠胸腺及外周血獲得單個(gè)核細(xì)胞,抽提其總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過(guò)real-time PCR檢測(cè)該細(xì)胞中FoxP3的mRNA水平;通過(guò)提取樣本中的總蛋白,采用western blot定量檢測(cè)FoxP3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果1.成功建立孕鼠模型合籠后次日發(fā)現(xiàn)陰栓即認(rèn)為雌鼠已受孕。在GD16給予孕鼠尾靜脈注射15μg SEB,然后讓其繼續(xù)妊娠至孕期滿,待其自然分娩,則表明孕鼠模型建立成功,模型成功率70-80%。2.妊娠期孕鼠注射SEB對(duì)新生子代鼠Treg細(xì)胞的影響(1)妊娠期孕鼠注射SEB對(duì)出生后第1、3、5天新生子代鼠胸腺及外周血中Treg細(xì)胞的百分比并無(wú)影響,但明顯增加新生子代鼠胸腺及外周血中Treg細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。(2)妊娠期孕鼠注射SEB明顯增加新生子代鼠第5天外周血中IL-10和TGF-β的含量。(3)妊娠期孕鼠注射SEB明顯增加出生后第1、3、5天新生子代鼠胸腺及外周血中FoxP3的mRNA及蛋白水平。3.妊娠期孕鼠注射SEB對(duì)成年子代鼠Treg細(xì)胞的影響(1)妊娠期孕鼠注射SEB對(duì)成年子代鼠胸腺及外周血中Treg細(xì)胞的百分比并無(wú)影響,但明顯增加成年子代鼠胸腺及外周血中Treg細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。(2)妊娠期孕鼠注射SEB明顯增加成年子代鼠外周血中IL-10和TGF-β的含量。(3)妊娠期孕鼠注射SEB明顯增加成年子代鼠胸腺及外周血中FoxP3的mRNA及蛋白水平。4.再次給予SEB對(duì)妊娠期注射SEB孕鼠的成年子代鼠Treg細(xì)胞的影響(1)PBS+SEB組與PBS+PBS組比較,胸腺中Treg細(xì)胞的比例明顯升高,而SEB+SEB組與PBS+SEB組比較明顯降低。SEB+PBS組與PBS+PBS組比較、SEB+SEB組與PBS+SEB組比較,胸腺中Treg細(xì)胞絕對(duì)數(shù)明顯升高,而PBS+SEB組與PBS+PBS組比較、SEB+SEB組與SEB+PBS組比較明顯降低。PBS+SEB組與PBS+PBS組,SEB+PBS組與PBS+PBS組比較,外周血中Treg細(xì)胞的比例明顯升高。SEB+PBS組與PBS+PBS組、PBS+SEB組與PBS+PBS組比較,外周血中Treg細(xì)胞絕對(duì)數(shù)明顯升高,而SEB+SEB組與SEB+PBS組、SEB+SEB組與PBS+SEB組比較則降低。(2)SEB+PBS組、PBS+SEB組與PBS+PBS組比較外周血中IL-10和TGF-β的含量明顯升高,而SEB+SEB組與PBS+SEB組、SEB+PBS組比較明顯降低。(3)SEB+PBS組、PBS+SEB組與PBS+PBS組比較,胸腺和外周血中FoxP3的mRNA和蛋白水平明顯升高,而SEB+SEB組與PBS+SEB組、SEB+PBS組比較明顯降低。結(jié)論1.妊娠期孕鼠注射SEB可對(duì)其新生子代鼠中樞和外周的Treg細(xì)胞、轉(zhuǎn)錄因子FoxP3和細(xì)胞因子產(chǎn)生正向調(diào)節(jié)作用,使其升高。2.妊娠期孕鼠注射SEB對(duì)其成年子代鼠中樞和外周的Treg細(xì)胞、轉(zhuǎn)錄因子FoxP3和細(xì)胞因子產(chǎn)生正向調(diào)節(jié)作用,使其升高,且與新生子代鼠的變化趨勢(shì)一致,表明妊娠期孕鼠注射SEB對(duì)子代鼠Treg細(xì)胞的影響可以從新生期保留至成年期,形成印跡效應(yīng)。3.妊娠期孕鼠注射SEB可改變成年子代鼠中樞和外周Treg細(xì)胞對(duì)再次給予SEB的應(yīng)答能力。
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R714;R-332
【圖文】：

結(jié)果1.妊娠期孕鼠注射 SEB 對(duì)新生子代鼠 Treg 細(xì)胞影響的研究1.1 妊娠期孕鼠注射 SEB 對(duì)新生子代鼠 Treg 細(xì)胞數(shù)量的影響流式檢測(cè)圖（圖 1）發(fā)現(xiàn)，妊娠期孕鼠注射 SEB 對(duì)新生子代鼠胸腺（圖 2A）及外周血（圖 3A）中 Treg 細(xì)胞的百分比并無(wú)影響，但明顯增加新生子代鼠胸腺（圖 2B）及外周血（圖 3B）中 Treg 細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。

圖 2 妊娠期孕鼠注射 SEB 對(duì)新生子代鼠胸腺 Treg 細(xì)胞的影響.（注：A，Treg 百分比，B，Treg 絕對(duì)數(shù)，#，P＜0.05,*，P＜0.01）Fig2：Effects of SEB exposure in pregnant rats on thymus Treg cells in neonatal offspring.（Note：A,Percentage of Treg cells,B,The absolute number of Treg cells, #,P＜0.05,*,P＜0.01）圖 3 妊娠期孕鼠注射 SEB 對(duì)新生子代鼠外周血 Treg 細(xì)胞的影響.（注：A，Treg 百分比，B，Treg 絕對(duì)數(shù)，#，P＜0.05，*，P＜0.01）Fig3：Effects of SEB exposure in pregnant rats on peripheral blood Treg cells in neonataloffspring.

圖 2 妊娠期孕鼠注射 SEB 對(duì)新生子代鼠胸腺 Treg 細(xì)胞的影響.（注：A，Treg 百分比，B，Treg 絕對(duì)數(shù)，#，P＜0.05,*，P＜0.01）Fig2：Effects of SEB exposure in pregnant rats on thymus Treg cells in neonatal offspring.（Note：A,Percentage of Treg cells,B,The absolute number of Treg cells, #,P＜0.05,*,P＜0.01）

【參考文獻(xiàn)】

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1 管俊昌;劉勇;孔曉明;朱翔;余峰玲;林娜;劉從森;張濤;;妊娠期母鼠給予葡萄球菌腸毒素B對(duì)成年子代CD3~+TCR Vβ8~+T細(xì)胞的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2012年09期

2 李賓;吳福玲;馮學(xué)斌;孫大康;李營(yíng)營(yíng);趙志旭;;呼吸道合胞病毒毛細(xì)支氣管炎患兒外周血CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及IL-10、TGF-β檢測(cè)及意義[J];濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2011年06期

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本文編號(hào)：2798122