【摘要】：天然免疫是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防線。在病毒入侵機體之后,宿主的模式識別受體(PRR,pattern recognition receptors)能夠迅速識別來自病毒的病原相關(guān)分子模式(PAMP,pathogen-associated molecular patterns),并積極做出免疫應(yīng)答。維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體家族(RLR,retinoic acid-inducible gene-Ⅰ(RIG-Ⅰ)-like receptors)是新近發(fā)現(xiàn)的RNA識別受體。RLR包括三個成員,分別是 RIG-Ⅰ,黑色素瘤分化相關(guān)抗原 5(MDA5,melanoma differentiation-associated gene 5)和遺傳學(xué)和生理學(xué)實驗室蛋白2(LGP2,laboratory of genetics and physiology 2)。RIG-Ⅰ和MDA5在識別外源RNA之后,可以通過一系列信號活化引起Ⅰ型干擾素及炎性細胞因子的大量表達,從而幫助機體迅速建立起應(yīng)對病毒的狀態(tài)。另一方面,MDA5和RIG-Ⅰ的過量表達及活化還能夠引起自身免疫疾病及自身炎癥疾病的發(fā)生。因此,MDA5及RIG-Ⅰ的表達及活化需受到精確調(diào)控,有關(guān)其精確調(diào)控方式與相關(guān)機制的研究是天然免疫領(lǐng)域的前沿?zé)狳c。泛素化修飾是調(diào)節(jié)RIG-Ⅰ及MDA5分子表達及活性的重要的翻譯后修飾(PTM,post-translation modification)之一。已知 TRIM25(tripartite interaction motif 25)、TRIM4、RNF135(RING finger protein 135)、MEX3C、RNF125、RNF122、c-Cbl 和 CHIP(carboxyl terminus of HSC70-interacting protein)能夠通過對 RIG-Ⅰ進行K63位或K48位泛素化修飾而調(diào)節(jié)RIG-Ⅰ的活化或表達。然而,是否存在通過泛素化修飾從而調(diào)節(jié)MDA5的表達及活性的E3泛素連接酶目前尚不清楚;是否存在能夠精確調(diào)控RLR表達的其他類型泛素化修飾也需要進一步明確。TRIM40是E3泛素連接酶TRIM家族成員之一。TRIM40定位于主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類基因區(qū)(MHC Ⅰ),與其他多個TRIM家族分子共同形成了一個緊密基因簇。多項研究表明,位于該基因簇的TRIM成員在天然免疫調(diào)節(jié)方面具有重要作用,包括TRIM15、TRIM26、TRIM31和TRIM39等。然而,TRIM40分子在天然免疫調(diào)節(jié)中是否發(fā)揮作用尚不清楚。在本文中,我們發(fā)現(xiàn)TRIM40缺陷能夠特異性促進RNA病毒仙臺病毒(SeV,Sendai virus)和水皰性口炎病毒(VSV,vesicular stomatitis virus)感染引起的 IFN-β及炎癥因子的表達,而對LPS和poly(I:C)誘導(dǎo)的信號通路沒有影響。對TRIM40缺陷細胞進行MDA5和RIG-Ⅰ特異性配體(長鏈和短鏈poly(I:C))轉(zhuǎn)染,可發(fā)現(xiàn)IFN-β轉(zhuǎn)錄較野生型細胞均有上調(diào)。通過報告基因檢測IRF3和NF-κB啟動子區(qū)活性,及Western blot檢測SeV感染后信號分子的磷酸化水平,發(fā)現(xiàn)TRIM40特異性抑制RLR介導(dǎo)的IRF3和NF-κB信號通路活化。RNA病毒感染后,TRIM40表達下調(diào),說明TRIM40是抗病毒天然免疫反應(yīng)中的反饋調(diào)節(jié)因子。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn),Trim40-/-小鼠腹腔注射SeV或VSV病毒后,能引起更強烈的天然免疫反應(yīng),且生存率顯著提高。我們進一步對TRIM40作用機制進行了研究。通過向HEK293T細胞中高表達RLR信號通路中的相關(guān)信號分子進行報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn),TRIM40的作用位點位于MAVS或MAVS上游。免疫共沉淀實驗進一步確認TRIM40能夠與MDA5和RIG-Ⅰ結(jié)合。利用截短體質(zhì)粒及免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)TRIM40可以通過其CC(coiled-coil)結(jié)構(gòu)域與 MDA5 和 RIG-Ⅰ 的 CARD(caspase activation and recruitment domain)結(jié)構(gòu)域結(jié)合。chase 實驗證明 TRIM40 參與了 MDA5 和 RIG-Ⅰ的降解過程,同時MDA5和RIG-Ⅰ的降解過程可被蛋白酶體抑制劑逆轉(zhuǎn),說明TRIM40對底物的降解是通過蛋白酶體途徑。二次免疫共沉淀檢測MDA5及RIG-Ⅰ泛素化修飾情況,證實了 TRIM40能夠直接催化MDA5和RIG-Ⅰ的K27位和K48位泛素化修飾。我們利用MDA5及RIG-Ⅰ CARD結(jié)構(gòu)域截短體,證明了 TRIM40能夠通過泛素-蛋白酶體途徑降解MDA5及RIG-Ⅰ CARD結(jié)構(gòu)域并下調(diào)RLR信號通路活化。為明確TRIM40對MDA5和RIG-Ⅰ的作用位點,我們構(gòu)建了位于MDA5 CARD結(jié)構(gòu)域上的點突變體,確定了 TRIM40催化MDA5的多聚泛素化修飾位點是K23、K43和K68。我們的研究揭示了 TRIM40通過介導(dǎo)MDA5、RIG-Ⅰ的K27位和K48位泛素化降解從而抑制RLR信號通路及IFN-β產(chǎn)生的分子機制;首次發(fā)現(xiàn)了 MDA5和RIG-Ⅰ的K27位泛素化并證實K27位泛素化修飾參與了蛋白酶體途徑的降解;首次確定了 MDA5能夠發(fā)生泛素化修飾的位點。我們的發(fā)現(xiàn)豐富了參與抗病毒天然免疫反應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)研究,也為抗病毒和自身免疫疾病的未來治療提供了潛在的靶點與新思路。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R392
【圖文】：

人源仞基因位于ＭＨＣ邋Ｉ類分子基因區(qū)，介于ＨＬＡ－Ａ和ＨＬＡ－Ｅ之間；逡逑類似地，鼠源基因則定位于小鼠ＭＨＣ邋Ｉ基因區(qū)相應(yīng)的Ｈ２－Ｍ及Ｈ２－Ｔ之逡逑間（圖１．１），與多種ＴＲＩＭ家族分子形成了緊密的基因簇。由于該基因簇內(nèi)多種逡逑ＴＲＩＭ分子均在天然免疫中發(fā)揮重要作用，提示了邋ＴＲＩＭ４０也可能參與天然免疫逡逑調(diào)控。逡逑Ａ邐一逡逑０．１Ｍｂ逡逑Ｈｕｍａｎ邋Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ邋６逡逑？番邐Ｉ逡逑？邐＂＂＂邋ｔ邋ｒ邋Ｔ邋Ｔ逡逑ＬＵ邐0邐＜邋Ｏ邋ＬＬ逡逑ｉ邐ｉｉｉ逡逑工邐ａ：邐工工工逡逑Ｂ邐０．１Ｍｂ逡逑Ｍｏｕｓｅ邋Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ邋１７逡逑ｉ邐？馨寒邐《｜（｜｜（｜＿蠢逡逑Ｉ邐ｉ邐Ｉ逡逑２邐ＯＨ逡逑空邐Ｉ空逡逑N邐ｃｒ逡逑Ｈ逡逑圖１．１邋７Ｗ／ｗ洲基因位于ＭＨＣ邋Ｉ類分子基因區(qū)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｔｒｉｍ４０邋ｇｅｎｅ邋ｌｏｃａｔｅｄ邋ｗｉｔｈｉｎ邋ｔｈｅ邋ＭＨＣ邋ｃｌａｓｓ邋Ｉ邋ｒｅｇｉｏｎ．逡逑（Ａ）邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＭＨＣ－ｅｎｃｏｄｅｄ邋ＴＲＩＭ邋ｆａｍｉｌｙ邋ｍｅｍｂｅｒ邋ｇｅｎｅｓ邋ｉｎ逡逑ｈｕｍａｎ邋ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．邋（Ｂ）Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＭＨＣ－ｅｎｃｏｄｅｄ邋ＴＲＩＭ邋ｆａｍｉｌｙ逡逑ｍｅｍｂｅｒ邋ｇｅｎｅｓ邋ｉｎ邋ｈｏｕｓｅ邋ｍｏｕｓｅ邋ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．逡逑為了研宄ＴＲＩＭ４０是否在天然免疫調(diào)控中發(fā)揮作用

ＴＲＩＭ４０缺陷細胞能夠顯著上調(diào)ＲＮＡ病毒仙臺病毒（ＳｅＶ）及水皰性口腔炎病毒逡逑（ＶＳＶ）誘導(dǎo)的ＩＦＮ－ｐ以及炎性細胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－６分泌，而ＬＰＳ及ｐｏｌｙ邋（Ｉ：Ｃ）逡逑處理后并無變化（圖１．３Ａ－Ｃ）。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑１５０１邐＾邋＊＊邐□邋ｒｒ／ｍ４０＊Ａ邋４０１邐□邋Ｔｒｉｍ４０ｔｎ逡逑：邐．一邋■邋Ｔｒｉｍ４０＇邋一邐２邋ｎｓ邋■Ｔｒｉｍ４０ｌ逡逑ｒ邋ｕ＼ｍｔＭｌ逡逑１邋ｉＪＩｌｌｌ．邋＾邋：ｕｉｋ逡逑ｃ逡逑ＡＨ邋ｎ逡逑＊＊邐ｎｓ邐□邋Ｔｒｉｍ４０Ｈ＊逡逑＾邐＾邐■邋Ｔｒｉｍ４（ｙ逡逑ｉ２０－邐ｎ邐ｄ逡逑？邋１０．邐ｔ．＊邋Ｉ逡逑0Ｌ．－ｎ｜邋１１１邋ｌｌｌａｉ逡逑￥孑彡夕ｆ逡逑圖１．３邋ＴＲＩＭ４０特異性抑制ＲＮＡ病毒引起的細胞因子分泌逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．３邋ＴＲ１Ｍ４０邋ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ邋ＲＮＡ邋ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．逡逑（Ａ）邋ＥＬＩＳＡ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ＩＦＮ－Ｐ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ｆｒｏｍ邋Ｔｒｉｍ４０＋／＋逡逑２２逡逑

在外源性實驗中，ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中過表達ＴＲＩＭ４０全長質(zhì)粒能夠顯著抑制逡逑ＳｅＶ誘導(dǎo)的ＩＦＮ－ｐ報告基因活性，而高表達缺失ＲＩＮＧ結(jié)構(gòu)域的ＴＲＩＭ４０截短體逡逑質(zhì)粒則對ＩＦＮ－（３報告基因活性沒有影響（圖１．５）。逡逑．邐ｎｓ逡逑％邋１５］邐□邋Ｃｔｒｌ逡逑｜邐Ｔ邋Ｔ邋■邋ＴＲＩＭ４０逡逑０邋１０－邐｜｜邋W邋ＴＲＩＭ４０ＡＲＩＮＧ逡逑＾邋Ｃ0會逡逑圖１．５邋ＴＲＩＭ４０特異性抑制ＲＮＡ病毒誘導(dǎo)的ＩＦＮ－Ｐ表達逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．５邋ＴＲＩＭ４０邋ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ邋ＲＮＡ邋ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ＩＦＮ－ｐ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．逡逑ＨＥＫ２９３Ｔ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＩＦＮ－Ｐ邋ｒｅｐｏｒｔｅｒ邋ｐｌａｓｍｉｄ，邋ｔｏｇｅｔｈｅｒ邋ｗｉｔｈ逡逑ＴＲＩＭ４０，邋ＴＲＩＭ４０邋ＲＩＮＧ邋ｄｏｍａｉｎ邋ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ邋ｍｕｔａｎｔ邋（ＡＲＩＮＧ）邋ｏｒ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｐｌａｓｍｉｄ，逡逑ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＳｅＶ邋ｆｏｒ邋１２邋ｈ，邋ａｎｄ邋ｔｈｅｎ邋ａｎａｌｙｚｅｄ邋ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ．邋Ｄａｔａ邋ａｒｅ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ逡逑ｏｆ邋ｔｈｒｅｅ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ邋ａｎｄ邋ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ邋ａｓ邋ｍｅａｎｓ邋±邋ＳＤ．邋＊，ｐ＜０．０５，邋＊＊，／？＜０．０１．逡逑為進一步驗證以上現(xiàn)象確實是由ＴＲＩＭ４０所引起的，我們利用ＴＲＩＭ４０基因逡逑敲除小鼠胚胎成纖維細胞進行了回復(fù)實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ＴＲ１Ｍ４０缺陷細胞較野生逡逑型細胞在ＳｅＶ感染后能夠引起更多的ＩＦＮ－（３轉(zhuǎn)錄

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本文編號：2798022