【摘要】：作為機體抵抗病原微生物入侵的第一道防線,天然免疫系統(tǒng)主要通過一系列模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)識別結(jié)構(gòu)上較保守的病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)或探測自身異常細(xì)胞來源的危險相關(guān)分子模式(danger associated molecular pattern,DAMP)以監(jiān)控病原體感染或感知細(xì)胞生存壓力。模式識別受體被激活后將進一步活化相應(yīng)下游信號通路,最終激活NF-κB、AP-1和IRF等轉(zhuǎn)錄因子以驅(qū)動炎性細(xì)胞因子、趨化因子及干擾素的轉(zhuǎn)錄活化,殺傷并清除入侵病原體或自身異常的組織細(xì)胞,保護機體健康。翻譯后修飾(post-translational modification,PTM)是蛋白質(zhì)功能調(diào)控的重要方式,其中泛素化修飾由E1-E2-E3泛素酶系統(tǒng)與去泛素化酶共同調(diào)節(jié),在抗原提呈、細(xì)胞分化、免疫防御與炎癥等諸多免疫過程中扮演重要角色。泛素是由76個氨基酸殘基構(gòu)成的高度保守的小分子多肽,單體分子量為8.6kDa,可通過本身Lys 6、11、27、29、33、48、63七個賴氨酸殘基或頭尾相連形成線性泛素化修飾。目前研究最為成熟的是介導(dǎo)蛋白酶體途徑降解的K48連接泛素化修飾以及與蛋白激酶活化相關(guān)的K63連接泛素化修飾。去泛素化酶能夠與泛素修飾系統(tǒng)共同調(diào)控某一蛋白位點的泛素化水平,由于泛素可以多種方式多聚化偶聯(lián),在蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)過程中作用廣泛且重要。去泛素化酶分類上屬于蛋白水解酶超家族,家族成員眾多,絕大多數(shù)為半胱氨酸蛋白酶,但功能和機制研究仍然不十分完善,其在天然免疫應(yīng)答調(diào)控中的作用仍有待進一步研究。在本課題中,我們通過去泛素化酶家族小干擾RNA(siRNA)文庫去篩選并試圖發(fā)現(xiàn)在天然免疫細(xì)胞抗病毒感染模型中具有顯著功能的潛在研究對象。針對篩選體系所采用的VSV、SeV和HSV-1感染模型,我們分別篩選得到了一系列調(diào)控抗病毒天然免疫信號的潛在研究對象,其中一些已被報道并與我們所篩選得到的效應(yīng)一致,這印證了我們篩選體系的可行性。對于大部分在天然免疫調(diào)控研究領(lǐng)域尚未被報道的去泛素化酶基因,我們優(yōu)先選擇在不同種類病毒感染模型中具有一致且最顯著差異表型的BRCA1相關(guān)蛋白1(BRCA1-associated protein 1,BAP1)作為研究對象,以期發(fā)現(xiàn)具有普適性的天然免疫抗病毒調(diào)控機制。已有研究表明BAP1參與了細(xì)胞周期、分化、轉(zhuǎn)錄和DNA損傷修復(fù)等許多重要生命過程,而BAP1的突變會提高黑色素瘤、間皮瘤、腎細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤的發(fā)病幾率,但BAP1在天然免疫應(yīng)答調(diào)控的作用尚不清楚,值得進一步研究。通過體外功能實驗,我們發(fā)現(xiàn)BAP1能夠顯著上調(diào)病毒感染與外源性核酸模擬物誘導(dǎo)的I型干擾素的表達(dá)和分泌,增強細(xì)胞抗病毒感染能力并顯著抑制病毒胞內(nèi)復(fù)制增殖。由于BAP1基因缺陷小鼠胚胎致死,即使髓系特異性敲除也會引發(fā)髓系細(xì)胞白血病,因而我們嘗試?yán)寐《靖腥疽吧托∈蠓闻K的方法構(gòu)建了BAP1肺臟特異性過表達(dá)及敲低小鼠模型。通過體內(nèi)肺臟流感病毒感染模型,我們發(fā)現(xiàn)BAP1能夠誘導(dǎo)I型干擾素與炎癥因子的分泌并增強干擾素刺激基因的表達(dá),從而抑制流感病毒在肺臟的復(fù)制增殖。此外,BAP1可以緩解流感病毒感染導(dǎo)致的肺組織炎性細(xì)胞浸潤及小鼠體重減輕,能夠延長致死劑量感染小鼠的生存期并提高其生存率。在機制研究中,通過干擾原代巨噬細(xì)胞中BAP1的表達(dá),我們發(fā)現(xiàn),BAP1的表達(dá)下調(diào)會顯著抑制病毒感染誘導(dǎo)的IRF3的磷酸化而對其他信號通路分子無明顯影響。通過熒光素酶報告基因?qū)嶒炍覀儼l(fā)現(xiàn),BAP1能有效增強IRF3及其上游信號通路分子誘導(dǎo)的IFNβ基因表達(dá)的活化。通過構(gòu)建BAP1截短體結(jié)合報告基因?qū)嶒?BAP1對IFNβ基因表達(dá)的活化效應(yīng)依賴于其泛素化酶活性及核定位。進一步實驗發(fā)現(xiàn),BAP1能夠促進病毒刺激下IRF3二聚化及核轉(zhuǎn)位。利用外源性免疫共沉淀篩選信號通路分子,BAP1能夠與IRF3顯著相互作用,我們進一步在原代巨噬細(xì)胞中驗證了內(nèi)源性BAP1與IRF3的結(jié)合。利用BAP1截短體進行免疫共沉淀實驗,結(jié)果表明BAP1與IRF3的相互作用主要依賴于BAP1 UCH-H區(qū)域。接下來的實驗證明,BAP1的表達(dá)降低會促進IRF3蛋白酶體途徑降解,并進一步驗證BAP1能夠下調(diào)IRF3 K48泛素化修飾水平而對其他類型泛素化修飾無明顯影響。為了進一步明確BAP1的作用機制,我們利用分離胞漿胞核組分后免疫共沉淀的方式發(fā)現(xiàn)二者均見BAP1與IRF3的相互作用,但胞核中結(jié)合隨病毒感染增強。值得注意的是,我們發(fā)現(xiàn)病毒感染誘導(dǎo)的IRF3 K48泛素化修飾主要發(fā)生在胞核組分中,并且BAP1主要抑制胞核中IRF3的降解。進一步實驗發(fā)現(xiàn),能與IRF3相互作用且具有去泛素化酶活性的BAP1 UCH-H截短體由于缺乏入核能力并不能有效抑制核內(nèi)IRF3的K48泛素化修飾及降解。查詢已有文獻報道,未見IRF3 K48泛素化修飾明確位點,因此挑選人鼠間保守的14個潛在泛素化賴氨酸位點構(gòu)建Lys-Arg點突變體。實驗結(jié)果表明Lys77和Lys87是IRF3 K48泛素化修飾的關(guān)鍵位點,突變后顯著抑制IRF3降解,構(gòu)建雙位點突變體后實驗發(fā)現(xiàn),IRF3 K77/87R雙位點突變較K77R K87R單位點突變進一步抑制IRF3降解并增強IFNβ報告基因的活化,但對病毒感染誘導(dǎo)的IRF3核轉(zhuǎn)位無明顯差異。利用野生型及單、雙位點IRF3突變體進行免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn),過表達(dá)BAP1可以下調(diào)WT IRF3及IRF3 K87R點突變體K48泛素化修飾水平而對IRF3 K77R及K77/87R突變體K48泛素化修飾水平無明顯影響,這一結(jié)果提示BAP1特異性作用于Lys77位點去泛素化修飾。為了進一步明確負(fù)責(zé)IRF3 Lys77位點K48泛素化修飾的E3泛素連接酶,我們篩選已被報道IRF3 K48連接泛素化修飾E3,發(fā)現(xiàn)UBE3C能夠顯著增強Lys77位點的泛素化水平,TRIM26能夠增強Lys87位點的泛素化水平。在病毒感染早期BAP1明顯升高而在后期逐漸恢復(fù)正常水平,而UBE3C表達(dá)水平晚于BAP1也有所升高并最終恢復(fù)到正常水平。我們的研究提示,在病毒急性感染期,BAP1表達(dá)升高并抑制核內(nèi)IRF3 K48連接泛素化修飾介導(dǎo)的降解以放大抗病毒免疫效應(yīng);在感染后期,UBE3C表達(dá)逐漸增高并逆轉(zhuǎn)BAP1的促炎效應(yīng),使IRF3活化恢復(fù)到正常水平以免過度應(yīng)答損傷機體。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了抑癌基因BAP1正向調(diào)控抗病毒天然免疫應(yīng)答的新功能,鑒定出抗病毒天然免疫信號通路中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子IRF3上能夠被K48泛素化修飾的位點Lys77和Lys87,同時揭示了E3泛素連接酶UBE3C能夠與BAP1拮抗調(diào)節(jié)IRF3的新機制,進一步完善了IRF3表達(dá)水平與功能的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),同時也為進一步理解BAP1的抑癌機制提供了新思路,為干預(yù)癌癥與病毒感染提供了潛在作用靶點。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R392
【圖文】：

pcDNA3.1/Myc(-)B質(zhì)粒圖譜

pMIR-REPORT質(zhì)粒圖譜

pRL-Renilla-TK熒光素酶內(nèi)參質(zhì)粒圖譜

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;我國科學(xué)家揭示抗病毒天然免疫新機制[J];生物學(xué)通報;2016年07期

2 ;中科院研究魚類抗病毒天然免疫獲進展[J];水產(chǎn)養(yǎng)殖;2012年01期

3 ;細(xì)胞抗病毒天然免疫研究有新成果[J];山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報;2009年02期

4 舒紅兵;;抗病毒天然免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵接頭蛋白的發(fā)現(xiàn)[J];科學(xué)觀察;2009年05期

5 李國勤;盧立志;;動物關(guān)鍵模式識別受體及其抗病毒天然免疫作用研究進展[J];生命科學(xué);2011年01期

6 孫莉;劉殿波;楊宇東;邢雅玲;陳曉娟;陳忠斌;;人類冠狀病毒調(diào)節(jié)宿主抗病毒天然免疫分子機制[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2010年03期

7 曹盼;胡浩;羅威偉;李姝;;抗病毒天然免疫、炎癥與癌變機制[J];中國基礎(chǔ)科學(xué);2018年01期

8 郟凱威;侯晉;;RIG-I在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用[J];中國腫瘤生物治療雜志;2018年07期

9 ;miR-132通過抑制轉(zhuǎn)錄共激活因子p300的活性調(diào)節(jié)抗病毒天然免疫應(yīng)答[J];微生物與感染;2010年02期

10 ;我國科學(xué)家填補病毒核酸信號傳導(dǎo)研究一項空白[J];中國科技產(chǎn)業(yè);2009年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 李國勤;盧立志;;動物模式識別受體介導(dǎo)的抗病毒天然免疫作用[A];全國動物生理生化第十一次學(xué)術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2010年

2 孫東豪;王春梅;曹雪濤;;CBX2的抗病毒天然免疫調(diào)控機制研究[A];第十二屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會摘要匯編[C];2017年

3 劉洋;曹雪濤;;LncBC473在抗病毒天然免疫中的作用與機制研究[A];第十三屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會摘要匯編[C];2018年

4 劉瑋;王子喬;劉倫;曹雪濤;;LncRNA1在抗病毒天然免疫應(yīng)答中的作用及其相關(guān)的機制研究[A];第十三屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會摘要匯編[C];2018年

5 劉冰玉;楚紅蕾;張洪海;吳海峰;張磊;高成江;;TRIM31在抗病毒天然免疫中的功能及其機制研究[A];第十二屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會分會場交流報告集[C];2017年

6 周卓;賈雪;薛清華;趙振東;金奇;王健偉;;TRIM14蛋白參與抗病毒天然免疫反應(yīng)[A];第九屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2014年

7 蔣爭凡;;ERIS-TBK1通路在抗病毒天然免疫中作用的研究[A];免疫細(xì)胞生物學(xué)熱點研究進展——海峽兩岸免疫細(xì)胞生物學(xué)研討會論文摘要集[C];2013年

8 李雪蓮;俞宙;楊明金;黃佳穎;曹雪濤;陳濤涌;;TBK1的磷酸化修飾與抗病毒天然免疫調(diào)控[A];第十一屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會分會場交流報告集[C];2016年

9 沈泳;王賽賽;樊世杰;孫芳芳;孫仁;錢景;;絲蘇氨酸蛋白激酶Riok3在抗病毒天然免疫中的調(diào)控作用[A];浙江省免疫學(xué)會第十次學(xué)術(shù)大會論文集[C];2016年

10 孟慶文;周長良;王偉;張雅春;陳洪巖;;RIG-I遺傳修飾雞模型的抗病毒天然免疫機制研究[A];第十屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會匯編[C];2015年

相關(guān)重要報紙文章 前7條

1 記者蔣明 通訊員王懷民;細(xì)胞抗病毒天然免疫研究獲進展[N];健康報;2009年

2 王懷民邋魯偉;武漢大學(xué)在細(xì)胞抗病毒天然免疫領(lǐng)域取得重要進展[N];科技日報;2008年

3 記者 蔣明　通訊員 王懷民 魯偉;細(xì)胞抗病毒天然免疫研究有新成果[N];健康報;2008年

4 見習(xí)記者 辛雨;新型RNA分子可增強抗病毒天然免疫功能[N];中國科學(xué)報;2019年

5 王懷民　記者 趙鳳華;我科學(xué)家填補病毒核酸信號傳導(dǎo)研究一項空白[N];科技日報;2009年

6 記者 譚嘉;RNA病毒逃過機體免疫“伎倆”被識破[N];健康報;2013年

7 整理 蔣明 楊雪;做免疫反應(yīng)分子機制的探路者[N];健康報;2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 楊倩;人源血紅蛋白β亞基對RIG-Ⅰ/MDA5介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答的調(diào)控機制的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

2 劉翔;去泛素化酶BAP1在抗病毒天然免疫應(yīng)答中的作用與機制研究[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2019年

3 黃健;Ⅰ型單純皰疹病毒皮層蛋白VP22和UL46逃逸宿主抗病毒天然免疫的分子機制研究[D];蘇州大學(xué);2018年

4 張華;蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT6負(fù)向調(diào)節(jié)抗病毒天然免疫的效應(yīng)與機制研究[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

5 沈泳;絲蘇氨酸蛋白激酶Riok3在抗病毒天然免疫中的調(diào)控作用及其分子機制[D];浙江大學(xué);2017年

6 張圓;YTHDF3負(fù)向調(diào)控I型干擾素抗病毒天然免疫應(yīng)答及其機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2018年

7 陳仕龍;禽坦布蘇病毒誘導(dǎo)宿主抗病毒天然免疫應(yīng)答機制研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2017年

8 孫旭;人巨細(xì)胞病毒皮層蛋白pUL23對細(xì)胞抗病毒天然免疫的影響及工程化核酶P和EGS抑制CMV感染的研究[D];暨南大學(xué);2017年

9 任玉潔;USP25轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制及INKIT調(diào)控抗病毒天然免疫的功能與機制研究[D];武漢大學(xué);2018年

10 夏章傳;TAP1通過乾向TAK1復(fù)合物負(fù)向調(diào)控宿主抗病毒天然免疫應(yīng)答[D];武漢大學(xué);2018年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 馮文靖;甲型流感病毒NS1蛋白誘導(dǎo)A20和MCPIP1抑制宿主抗病毒天然免疫應(yīng)答的研究[D];吉林大學(xué);2019年

2 孔令麗;TRIM10在抗病毒天然免疫中的功能及其機制研究[D];山東大學(xué);2019年

3 徐海燕;Ⅰ型單純皰疹病毒通過UL24逃逸宿主抗病毒天然免疫作用的分子機制[D];蘇州大學(xué);2016年

4 宋金揚;RIG-I蛋白與TRIM25蛋白的相互作用研究[D];廈門大學(xué);2017年

5 龔恒林;豬偽狂犬病病毒感染細(xì)胞免疫效應(yīng)初步分析[D];福建師范大學(xué);2017年

6 楚紅蕾;YIPF5在抗病毒天然免疫中的功能及其機制研究[D];山東大學(xué);2018年

7 董思晗;HRIK在天然免疫信號通路中的功能研究[D];上海大學(xué);2017年

8 孫莉;人類新發(fā)NL63冠狀病毒木瓜樣蛋白酶調(diào)控宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)及其分子機制[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2010年

9 �，幀�;鯉魚RLR基因克隆及其免疫功能研究[D];山東師范大學(xué);2014年

10 師艷玲;豬ELF4的克隆及其在誘導(dǎo)IFN-β中的作用研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

本文編號：2798315