【摘要】：第一部分Skp2在早孕小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化中的作用目的:蛻膜細胞的增殖與凋亡的動態(tài)平衡是維持蛻膜化正常進行的關(guān)鍵。Skp2作為促進細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換的重要調(diào)控因子,它可以使cyclin、CKI等靶蛋白泛素化,從而調(diào)節(jié)細胞周期,進而參與細胞增殖和凋亡的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn),Skp2在多種癌癥的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用,但其在早孕小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化中的作用尚不清楚。本研究擬在觀察Skp2在圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜表達規(guī)律的基礎(chǔ)上,初步探討Skp2在早孕小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化中的作用。方法:1.構(gòu)建早孕小鼠正常妊娠模型與假孕模型并用免疫組化與Western blot檢測Skp2的表達。2.構(gòu)建早孕小鼠體內(nèi)人工誘導(dǎo)蛻膜化模型并用免疫組化與Western blot檢測蛻膜化誘導(dǎo)前后Skp2的表達。3.構(gòu)建體外原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞蛻膜化誘導(dǎo)模型并用Western blot檢測細胞誘導(dǎo)前后Skp2的表達。4.構(gòu)建Skp2過表達的原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞蛻膜化誘導(dǎo)模型,Western blot檢測蛻膜標(biāo)志物BMP2、MMP2、HOXA10和Skp2在小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞中的蛋白表達;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。結(jié)果:1.Western blot和免疫組化結(jié)果顯示,隨著妊娠天數(shù)的遞增,Skp2在正常妊娠第5、6、7天(D5、D6、D7)的小鼠子宮內(nèi)膜組織的蛋白表達顯著低于正常妊娠第1天(D1);Skp2在正常妊娠D5、D6、D7子宮內(nèi)膜著床點組織的蛋白表達明顯低于D5、D6、D7的子宮內(nèi)膜著床旁組織。2.Western blot和免疫組化結(jié)果顯示,Skp2在假孕第4天(PD4)小鼠子宮內(nèi)膜組織的蛋白表達顯著高于PD6、PD7。3.Western blot和免疫組化結(jié)果顯示,蛻膜化誘導(dǎo)側(cè)子宮內(nèi)膜組織Skp2蛋白表達明顯低于未誘導(dǎo)側(cè)子宮內(nèi)膜組織。4.Western blot結(jié)果顯示,原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞蛻膜化誘導(dǎo)后Skp2蛋白表達明顯低于未誘導(dǎo)組,上調(diào)Skp2表達后,蛻膜標(biāo)志物BMP2、MMP2、HOXA10表達紊亂。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,上調(diào)Skp2表達后,細胞凋亡顯著增加。結(jié)論:該研究初步揭示了Skp2參與調(diào)節(jié)早孕小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化,其具體機制有待進一步研究。第二部分TFEB在早孕小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化中的作用目的:TFEB可通過調(diào)控自噬-溶酶體途徑在諸多生理病理過程中影響細胞凋亡。在蛻膜化進程中,蛻膜細胞的增殖與退化同時并存,二者在動態(tài)平衡中協(xié)調(diào)蛻膜細胞的數(shù)量和滋養(yǎng)細胞的侵蝕,維持蛻膜化的正常進行。課題組前期發(fā)現(xiàn)FOXO3a可能通過細胞凋亡途徑參與妊娠早期子宮內(nèi)膜蛻膜化。作為可被FOXO3a負調(diào)控的下游分子TFEB是否同樣參與妊娠早期子宮內(nèi)膜蛻膜化尚不清楚。因此,本研究旨在分析TFEB在圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜中的表達規(guī)律,初步探討TFEB在早孕小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化中的作用。方法:1.構(gòu)建早孕小鼠正常妊娠模型與假孕模型并用q PCR與Western blot檢測TFEB的表達。2.構(gòu)建早孕小鼠體內(nèi)人工誘導(dǎo)蛻膜化模型并用q PCR與Western blot檢測TFEB的表達。3.構(gòu)建體外原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞人工誘導(dǎo)蛻膜化模型并用q PCR與Western blot檢測TFEB的表達。結(jié)果:1.Western blot和Real-time PCR結(jié)果顯示,隨著孕期天數(shù)的增加,TFEB在D4、D5、D6的表達逐漸減少;Western blot、Real-time PCR和免疫組化的結(jié)果顯示,TFEB在D5子宮內(nèi)膜著床點組織的表達明顯低于D5子宮內(nèi)膜著床旁組織。2.Western blot和Real-time PCR結(jié)果顯示,小鼠體內(nèi)蛻膜化誘導(dǎo)側(cè)子宮內(nèi)膜組織TFEB表達明顯低于未誘導(dǎo)側(cè)子宮內(nèi)膜組織。3.Western blot和Real-time PCR結(jié)果顯示,原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞體外蛻膜化誘導(dǎo)后TFEB表達明顯低于未誘導(dǎo)組。結(jié)論:本研究初步揭示TFEB可能與妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化有關(guān),但其具體調(diào)節(jié)作用有待后續(xù)進一步深入探討。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R394
【圖文】：

娠 D5、D6、D7 著床點和著床旁組織中的表達。β-actin 作為內(nèi)參蛋白。*P<0.05，***P<0.001；IIS：著床旁子宮內(nèi)膜，IS：著床點子宮內(nèi)膜。n=3。Fig 1 Expression of Skp2 in the endometrium of early pregnant miceA：Protein expression of Skp2 in the endometrium of early pregnant mice on D1, D4, D5, D6,D7 (The right histogram is the grayscale statistical analysis of the left protein band). B:Western blot were used to detect the expression of Skp2 in implantation sites andinter-implantation site on D5, D6, D7 endometrium in early pregnant mice (The righthistogram is the grayscale statistical analysis of the left protein band). C:Immunohistochemistry were used to detect the expression of Skp2 in the endometrium of earlypregnant mice on D1, D4 and in implantation sites and inter-implantation site on D5, D6, D7endometrium in early pregnant mice (The right histogram is the grayscale statistical analysisof the left protein band). β-actin was used as a loading control; *P<0.05, ***P<0.001; IIS:inter-implantation site, IS: implantation site; n=3.

38圖 1 TFEB 在早孕小鼠子宮內(nèi)膜的表達情況A：TFEB 在早孕小鼠 D4、D5、D6 和 PD4、PD5、PD6 子宮內(nèi)膜中的蛋白表達情況（右側(cè)柱狀圖為左側(cè)蛋白條帶的灰度統(tǒng)計分析結(jié)果）；B：Real-time PCR 檢測結(jié)果；C：Western blot檢測結(jié)果（右側(cè)柱狀圖為圖 1C 蛋白條帶的灰度統(tǒng)計分析結(jié)果）；D：免疫組化檢測 TFEB 在

圖 2 小鼠體內(nèi)子宮內(nèi)膜人工誘導(dǎo)蛻膜化后 TFEB 表達減少A：小鼠體內(nèi)子宮內(nèi)膜人工誘導(dǎo)蛻膜化模型構(gòu)建；B：Real-time PCR 檢測顯示人工誘導(dǎo)蛻膜化后 TFEB mRNA 表達顯著減少；C：Western blot 檢測顯示人工誘導(dǎo)蛻膜化后 TFEB 蛋白表達顯著減少（右側(cè)柱狀圖為圖 2C 蛋白條帶的灰度統(tǒng)計分析結(jié)果）。β-actin 作為內(nèi)參蛋白；*P<0.05，**P<0.01。ID：蛻膜化誘導(dǎo)側(cè)，采用宮角注射玉米油的方法進行蛻膜化誘導(dǎo)；IDC：未誘導(dǎo)側(cè)，宮角未做任何處理。n=3。Fig 2 Expression of TFEB were decreased in vivo artificially induced decidualization modelA: Construction of artificially induced decidualization model of endometrium in mice. B:Real-time PCR results showed that TFEB mRNA expression was significantly decreased afterartificially induced decidualization. C: Western blot analysis showed that the expression ofTFEB protein was significantly decreased after artificially induced decidualization (The righthistogram is the grayscale statistical analysis of the left protein band). β-actin was used as aloading control; *P<0.05, **P<0.01; ID: decidualization-induced side, decidualization

【參考文獻】

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本文編號：2797648