【摘要】：第一部分 抗PCSK9短肽表位的篩選及其載體疫苗功能研究研究目的及背景:前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)自2003年發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直備受廣泛關(guān)注,由于它能與肝細(xì)胞表面的低密度脂蛋白受體(LDLR)結(jié)合,使后者進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/溶酶體被降解而不能再循環(huán)表達(dá)于細(xì)胞膜上,從而降低LDLR水平并達(dá)到升高低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的效果,因此PCSK9成為治療高膽固醇血脂甚至動(dòng)脈粥樣硬化性心血管病的新靶點(diǎn)。迄今為止,PCSK9抑制劑的研究也是層出不窮,包括單克隆抗體(簡(jiǎn)稱單抗)、反義寡核苷酸、疫苗等,其中部分研究取得相應(yīng)的成果,尤以單抗的研究最多,但由于其價(jià)格昂貴,半衰期短等原因而限制了在臨床上的應(yīng)用。由于疫苗有給藥劑量小,制備成本低,經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)降低等在治療慢性病上的優(yōu)勢(shì),所以針對(duì)PCSK9疫苗的研究就顯得尤為重要。本研究的目的主要為了篩選出多個(gè)不同的針對(duì)PCSK9的短肽表位,并將短肽分別與載體偶聯(lián)成疫苗,免疫動(dòng)物,繼而驗(yàn)證是否有降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和/或總膽固醇(TC)的效果,從而為高膽固醇血脂的防治提供一種新的手段。研究方法:首先,應(yīng)用相關(guān)的網(wǎng)站和軟件分析技術(shù)針對(duì)PCSK9蛋白的結(jié)構(gòu)和氨基酸序列篩選出多種可能成為免疫表位的短肽。其次,利用本課題組所掌握的疫苗制備技術(shù),分別將篩選出來(lái)的短肽通過(guò)異雙功能交聯(lián)劑Sulfo-SMCC(Pierce,USA)與載體Qβ-VLP進(jìn)行耦聯(lián),用SDS-PAGE凝膠電泳鑒定分析疫苗的偶聯(lián)率。再次,在體驗(yàn)證疫苗的效應(yīng)。以6周齡雄性Bal B/C作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,將制成的疫苗后對(duì)齊進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射免疫,整個(gè)實(shí)驗(yàn)需要觀察的指標(biāo)如下:1.抗體滴度測(cè)定:分別檢測(cè)不同的疫苗免疫后Anti-PCSK9抗體滴度及維持狀況。2.血脂監(jiān)測(cè):定期檢測(cè)總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)四項(xiàng)指標(biāo)。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)束分別用WB和q RT-PCR檢測(cè)肝臟組織LDLR水平等。結(jié)果:1.總共篩選出15個(gè)可作為免疫表位的短肽,氨基酸數(shù)目為別為7-10個(gè)不等。2.部分針對(duì)PCSK9的載體疫苗可以在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的Anti-PCSK9抗體,滴度經(jīng)過(guò)3-4次免疫強(qiáng)化后可以維持在較高水平,并直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。3.其中的一個(gè)載體疫苗PCSK9Qβ-003能夠降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血脂水平,尤其以LDL-C和TC顯著,但是不影響TC和HDL-C。4.PCSK9Qβ-003疫苗無(wú)論從蛋白還是m RNA水平均能增加肝臟組織LDLR的表達(dá)量。結(jié)論:針對(duì)PCSK9的15個(gè)短肽偶聯(lián)載體制成的疫苗中,其中PCSK9Qβ-003疫苗可以在Balb/c動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生較高并穩(wěn)定的抗體滴度水平,并且能夠降低動(dòng)物的LDL-C和TC。因此PCSK9Qβ-003疫苗可能成為治療高膽固醇血癥的一種新方法。第二部分 PCSK9Qβ-003疫苗在LDLR~(+/-)小鼠模型上的功能研究研究目的:本研究一方面為了進(jìn)一步驗(yàn)證PCSK9Qβ-003疫苗在LDLR+/-小鼠模型中的降脂效果,另外還研究了PCSK9Qβ-003疫苗是否能在LDLR+/-小鼠模型中對(duì)膽固醇代謝途徑的產(chǎn)生影響以及驗(yàn)證PCSK9Qβ-003疫苗是否安全可靠,便于今后此疫苗能應(yīng)用于高膽固醇血癥的臨床治療。研究方法:以6周雄性LDLR+/-小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,來(lái)研究PCSK9Qβ-003疫苗的功能。主要包括以下幾方面:1.抗體滴度測(cè)定:檢測(cè)PCSK9Qβ-003疫苗免疫后Anti-PCSK9抗體滴度及維持狀況。2.血脂監(jiān)測(cè):定期檢測(cè)總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)四項(xiàng)指標(biāo)。3.血清樣本檢測(cè):分別用ELISA檢測(cè)血清中PCSK9的總含量和游離PCSK9含量。4.肝臟組織標(biāo)本檢測(cè):用Western Blot和q RT-PCR分別檢測(cè)LDLR,SREBP-2,HNF-1α和HMG-Co A還原酶的表達(dá)量等。5.安全性研究:取新鮮脾臟組織用流式細(xì)胞數(shù)檢測(cè)Th1,Th2和Th17細(xì)胞比率,用血標(biāo)本檢測(cè)肌酐,尿素氮及部分炎癥因子的水平,另外取腎臟組織做HE,Masson和PAS染色觀察PCSK9Qβ-003疫苗的影響。結(jié)果:1.PCSK9Qβ-003疫苗可以刺激LDLR+/-小鼠產(chǎn)生高滴度的Anti-PCSK9抗體,滴度經(jīng)過(guò)3-4次免疫強(qiáng)化后可以維持在比較高的水平,并直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。2.PCSK9Qβ-003疫苗能夠降低LDLR+/-小鼠的血脂水平,尤其以LDL-C和TC顯著,但不影響TC和HDL-C。此外,聯(lián)合他汀藥物治療后可以將TC降低的更明顯。3.PCSK9Qβ-003疫苗可以升高血清PCSK9總含量,但降低游離PCSK9的含量。4.PCSK9Qβ-003疫苗能顯著性增加肝臟組織LDLR基因水平和蛋白水平的表達(dá)量,另外此疫苗還可以增加SREBP-2,HNF-1α和HMG-Co A還原酶的表達(dá)量。5.接受PCSK9Qβ-003疫苗免疫的小鼠中Th1,Th2和Th17細(xì)胞比率,血清肌酐,尿素氮和部分炎癥因子的含量,以及腎臟組織的HE,Masson和PAS染色均未見(jiàn)異常。結(jié)論:PCSK9Qβ-003疫苗可以降低LDLR+/-小鼠的血脂尤其TC和LDL-C,并增加肝臟LDLR含量,影響膽固醇代謝。而且PCSK9Qβ-003疫苗并不帶來(lái)血清學(xué)、腎臟大體及腎功能等方面的損害。因此我們推斷PCSK9Qβ-003疫苗可以作為治療高膽固醇血癥甚至動(dòng)脈粥樣硬化性心血管病的一種新手段。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 廖玉華;邱志華;陳霄;;血脂異常與高血壓的生物學(xué)治療[J];臨床心血管病雜志;2015年04期

本文編號(hào)：2796617